очищенными препаратами необходимо использовать искусственные буферы. До тех пор пока энзимологи не учитывали этого обстоятельства, ни о каких серьезных успехах в понимании особенностей ферментативной кинетики не могло быть и речи. Таким образом, развитие ферментативной кинетики на первых этапах сдерживалось недопониманием роли рН.

В общей химии ситуация совершенно иная: в водных растворах изучается лишь незначительная часть реакций, и при этом исследования проводят в основном либо при очень низких, либо при очень высоких значениях рН, когда концентрация водородных или соответственно гидроксильных ионов достаточно высока, чтобы ее можно было считать практически постоянной.

Простейший тип рН-зависимости скорости ферментативной реакции, наблюдаемый в том случае, когда в процессе ионизации участвует единственная кислая или основная группа, не отличается от общего случая гиперболического ингибирования иди активации, рассмотренного в гл. 4. С формальной точки зрения протонирование основной группы фермента представляет собой просто частный случай связывания модификатора на особом центре, и поэтому приводить снова алгебраические выкладки для этого простейшего случая нет необходимости. Однако между протонами и другими модификаторами существуют определенные различия, вследствие чего протоны целесообразно рассматривать . отдельно от модификаторов другого типа. Прежде всего активность практически всех ферментов зависит от концентрации протонов, и поэтому протон является гораздо более важным модификатором, чем любой другой модификатор. По своим размерам протон гораздо меньше всех химических соединений, и для него отсутствуют стерические ограничения. Это приводит к тому, что многие кинетические явления, невозможные для других модификаторов, для протона распространены весьма широко (например, чистое неконкурентное ингибирование). Концентрация протонов измеряется и контролируется в гораздо большем интервале, нежели при использовании любого другого модификатора, поэтому можно ожидать, что удастся зарегистрировать все вызываемые ими эффекты. Наконец, протоны обычно связываются с многими центрами в молекуле фермента, и для всестороннего анализа -рН-зависимости скорости ферментативной реакции рассмотреть связывание протона только с одним центром, как правило, недостаточно.

6.2. Ионизация двухосновной кислоты

, Молекула каждого фермента содержит большое число кислых и основных групп. В нейтральной области рН большая часть этих групп либо полностью депротонирована (аспартат и глутамат),

144

Глава 6

либо полностью протонирована (аргинин и лизин). Однако в молекуле фермента всегда имеется несколько групп со значениями рКа в интервале от 5 до 9; это в первую очередь имидазольная группа гистидина и сульфгидрильная группа цистеина. Сюда могут попасть также N-концевые аминогруппы и некоторые другие группы, значения трК которых сдвигаются под влиянием соответствующего окружения в белковой молекуле. Следовательно, молекула фермента непременно содержит несколько групп, состояние ионизации которых меняется при варьировании рН, и это обстоятельство, конечно, усложняет изучение ионизации фермента. Однако, к счастью, для описания поведения многих ферментов при варьировании рН в качестве первого приближения может быть использована простая модель, в которой принимаются во внимание только две ионизируемые группы. Эту модель впервые использовал Михаэлис [112]; в соответствии с ней фермент рассматривается как двухосновная кислота, НЕН, с двумя разными кислыми группами:

Для каждой стадии ионизации на схеме указана соответствующая константа диссоциации. Обозначим для удобства концентрацию водородных ионов [Н+1 через h; тогда в равновесных условиях концентрации всех форм фермента будут связаны с h соотношениями

относительно которых следует сделать два замечания. Во-первых, хотя константы Кц и K2l характеризуют отщепление протона от одной и той же группы, Кц должна быть больше K2i, т.е. Кц не может быть равной K2i, поскольку форма НЕ- имеет на один отрицательный заряд больше, чем НЕН, и является, таким образом, менее сильной кислотой. По аналогичным соображениям /Ci2 > К22. Во-вторых, выражение для концентрации формы Е2- должно иметь один и тот же вид независимо от того, приходим мы к нему от НЕН через ЕН~ или через НЕ- (в против-

[ЕН] [НЕ"] [Е2]

[НЕН]/с, А [НЕН]/С12/А,

[НЕН] Ки K22/W = [НЕН] Ка /f а/А«,

(6.1)

Влияние рН и температуры на ферменты

145

ном случае будет нарушен второй закон термодинамики). Поэтому два выражения для [Б8-] в уравнении (6.1) должны быть эквивалентны друг другу, и, следовательно, КцК^2 = /Ci2^2i-

Учитывая, что полная концентрация фермента е0 равна сумме концентраций всех его форм ([НЕН] +[ЕН"] 4- [НЕ-]+ + [Е2-]), получаем

[НЕН] =-~—f-__, (6.2)

, , Л11Т Л12 , Л11 Л22

1 4--4-'-

h h2

[EH"] = -'oKu/h-( (6 3)

• . ^11 + ^12 , ^11 ^22

1 4--4--

h Ь?

[НЕ-] =-eBK12/h-^ ^ ^

^11 4- ^12 . ^11 ^22

1 +

h*

[Е2~] = -gQ^n^a/fc2- (6.5)

. . ^11 + -Rig #11 Kjj

1 4--4--

h ^ h*

Эти выражения показывают, как зависят концентрации всех четырех форм от h (или — после несложных преобразований — от рН). Типичные зависимости [НЕН], [ЕН~], [НЕ-] и [Е2_] от рН при произвольных значениях констант диссоциации представлены на рис. 6.1. В реальном эксперименте получить подобные кривые с такой же степенью точности никогда не удается, поскольку невозможно одновременно определить все четыре константы диссоциации. Связано это с тем, что отношение [ЕН""]/[НЕ-] равно KiJKi2l т. е. постоянной величине, не зависящей o%„k. Это означает, что при любом изменении h изменение [ЕН-] сопровождается строго пропорциональным изменением [НЕ-]. Следовательно, определить, какой вклад в данное свойство фермента дает форма ЕН-, а какой — НЕ", невозможно. Поэтому на самом деле мы должны рассматривать ЕН" и НЕ" как единую форму, концентрация которой определяется выражением

[ЕН"] + [НЕ"] = е0 J {-^~ + 1 + , (6.6)

где

Ki = К„ + Ка =([ЕН~] + [НЕ-]) ЙДНЕН],

К2 = Ки ЫКп + К12) = [Е2] h/([EK-] + [ЕН-]).

Константы Ki и К2 называют молекулярными константами диссоциации, чтобы отличать их от констант диссоциации, харак-6—282

146

Глава 6

теризующих ионизацию индивидуальных групп Кц, Kl2, K2i и К22. С практической точки зрения константы К± и К2 имеют то преимущество, что их можно измерить, в то время как константы Кц, Ki2, K2i и К22, которые очень полезны для построения детальной схемы процесса ионизации фермента, определить из

эксперимента не удается, поскольку невозможно оценить величину К12/Кц.

Выражения для [НЕН] и [Е2 ] можно записать с использованием молекулярных констант диссоциации:

Уравнение (6.6) имеет смысл рассмотреть более детально, потому что для многих ферментов зависимость активности от рН графически представляется кривой колоколообразной формы, характерной для этого уравнения. С этой кривой связан ряд распространенных недоразумений. Во-первых, при некоторых значениях p/fi и р/С2 (т. е. —lg/^i и —lg/C2) она очень похожа на гауссову, однако на самом деле таковой не является. Это особенно хорошо

Влияние рН и температуры на ферменты

147

выявляется при (р/С2—pKi) > 3, когда максимум кривой сильно размывается. Во-вторых, значения рН, при которых ([ЕН-] + 4- [НЕ-]) составляет половину своего максимального значения, в общем случае нельзя считать равными соответственно р^С 4 и ргч2 или даже близкими к этим параметрам, если только разность (р/С2—p/Ci) не является достаточно большой, а это бывает не так

Рис. 6.2. Колоколообразные зависимости относительной концентрации однократно ионизированной^формы фермента от рН, построенные исходя из уравнения (6.6) для j>Ki '= 6,0 и значений p)f2 в интервале от 5,0 до 10,0. Числа у кривых означают разность (pKj —pKj), которой и определяется форма кривой.

часто. Однако среднее указанных двух значений рН равно (р/?! + p/f2)/2 и соответствует также величине рН, при которой кривая достигает максимума. Соотношения между полушириной кривой и разностью ($К2—p/ti) представлены в табл. 6.1, а несколько характерных колоколообразных кривых приведено на рис. 6.2. В-третьих, даже если предположить, что p/Ci и р/С2 определены правильно, значения констант диссоциации, характеризующих ионизацию индивидуальных групп, остаются неизвестными; для этого необходимо привлекать соображения вероятностного характера, основанные, однако, на недоказуемых допущениях. Наконец, хотя условие р/С2 < p/Ci в принципе выполнимо, на самом деле оно реализуется очень редко, потому что в этом случае процесс протонирования должен быть кооперативным ([43], см. также гл. 7) и соотношения между константами диссоциации индивидуальных групп (K±l > К21 и ^12 > К22) — те_ 6*

148 Глава 6

рять свою силу; если эти соотношения выполняются, то Kt должна составлять по меньшей мере АК2, т. е. (рК2 —pjRTi) > 0,6.

Таблица 6.1

СООТНОШЕНИЕ МЕЖДУ ПОЛУШИРИНОЙ1) И РАЗНОСТЬЮ ЗНАЧЕНИЯ рК ДЛЯ КОЛОКОЛООБРАЗНЫХ рН-ЗАВИСИМОСТЕЙ

Полуширина рК.-рК, Полуширина рКг-рК, Полуширина рК.-рК,

1.142) — оо 2,1 ' 1,73 3,1 3,00

1,2 — 1,27 2,2 1,88 3,2 • 3,11

1,3 — 0,32 2,3 2,02 3,3 3,22

1,4 0,17 2,4 2,15 3,4 3,33

1,5 0,51 2,5 2,28 3,5 3,44

1,6 0,78 2,6 2,41 3,6 3,54

1.7 1,02 2,7 2,53 ч 3,7 3,65

1,8 1,22 2,8 2,65 \ 3,8 3,76

1,9 1,39 2,9 2,77 3,9 3,86

2,0 1,57 3,0 2,88 4,0 3,96

*) Под полушириной подразумевается разность значений РН для точек, значения ординаты которых составляют половину максимального.

>) Значения полуширины, меньшие 1,14, возможны только для более сложного механизма ионизации, чем тот, который рассмотрен в тексте (например, для механизма, включающего более двух ионизируемых групп).

6.3. Влияние рН на константы скорости ферментативной реакции

Слегка модифицировав теорию ионизации двухосновной кислоты, можно использовать ее для анализа колоколообразных кривых, которым часто следуют рН-зависимости кинетических параме