тров ферментативной реакции V и VIKm- (Анализ рН-за-висимости параметра Kin, как будет видно ниже, довольно сложен.) Основной механизм ферментативной реакции с учетом ионизации фермента выглядит следующим образом:

Н,Е

HoES

и

,ES

^+2

S + НЕ" —^ HES" -^НЕ"+Р

А?

ES

2-

Влияние рН и температуры на ферменты

149

Свободный фермент снова рассматривается как двухосновная кислота Н2Е, характеризующаяся двумя молекулярными константами — Kf и К2 (как и в предыдущем разделе). Фермент-субстратный комплекс также считается двухосновной кислотой H2ES, но с константами диссоциации К^ и /iT^f.

В рассматриваемой схеме к каталитическому превращению с образованием продуктов способен только однократно ионизованный комплекс HES-. Необходимо отметить, что при составлении схемы сделан ряд неявных допущений, которые сильно упрощают картину. Прежде всего отсутствие стадий связывания субстрата для форм Н2Е и Еа~ означает, что стадии протонирования являются «тупиковыми» реакциями и поэтому их можно рассматривать как равновесные (разд. 3.6). Однако, поступая подобным образом, мы просто стремимся избежать трудностей в построении схемы, а не добраться до истины, потому что в большинстве случаев нет никаких оснований полагать, что субстрат (S) не может присоединяться непосредственно к Н2Е и Е2-. Если в схему включить стадии связывания S формами Н2Е и Е2-, то стадии протонирования перестают быть «тупиковыми» реакциями и их можно рассматривать как равновесные только в том случае, если допустить, что они являются очень быстрыми по сравнению с другими. Это допущение может показаться вполне естественным, если принять во внимание относительно простой характер рассматриваемой реакции, однако в некоторых случаях (в особенности когда протонирование индуцирует конформационное изменение) оно не выполняется.

В данной схеме подразумевается, что каталитическая реакция включает только две стадии, как и в простейшем механизме Михаэлиса — Ментен. Если ввести несколько дополнительных стадий и считать, что каждое промежуточное соединение способно к про-тонированию—депротонированию, то вид окончательного уравнения остается без изменений, однако при этом уже можно не надеяться, что нам удастся достаточно просто интерпретировать экспериментальные данные (сравните с результатом введения дополнительной стадии в простой механизм Михаэлиса—Ментен, разд. 2.6).

Наконец, допущение о том, что распадаться с образованием продуктов способна только форма HES", также не всегда верно; однако для многих ферментов, оно, по-видимому, вполне приемлемо, поскольку в большинстве случаев ферментативная активность приближается к нулю при высоких и низких значениях рН. Кроме того, согласно широко распространенной точке зрения, поразительная каталитическая эффективность многих ферментов обусловлена согласованным участием кислой и основной групп в каталитическом процессе.

150

Глава 6

Имея в виду, что рассмотренная схема выполняется лишь при самом благоприятном стечении обстоятельств, рассмотрим уравнение скорости, к которому она приводит. Если бы фермент был нечувствительным к изменению рН, т. е. если бы формы НЕ- и HES~ были единственными формами фермента, то схема существенно упростилась бы и превратилась в обычный механизм Михаэлиса —Ментен, для которого скорость задается выраже-

нием

v =

где V = k+2e0 и Км = (fc_i + fc+2)/fe+i — параметры V и Км,

скорректированные с учетом рН. Параметры V и Км вводятся для удобства, они аналогичны «ожидаемым» значениям параметров (см. разд. 4.8, посвященный непродуктивному связыванию). Однако в действительности как НЕ- не является единственной формой свободного фермента, так и HES- не является единственной формой фермент-субстратного комплекса. Полное уравнение скорости имеет следующий вид:

• еп s

h J А

т«т-г|^т^Й

\Kf h J k+1 ' \

Его можно записать в таком виде:

где

H^+l+^N(^+l+^)' (6-8)

Зависимость V от h описывает ионизацию фермент-субстратного комплекса, а VIKm от h — ионизацию свободного фермента. Зависимость же от рН параметра Км, как и ранее, более сложна, поскольку Км определяется ионизацией как свободной формы, так и фермент-субстратного комплекса. рН-зависимости параметров

Влияние рИ и температуры на ферменты

151

V и V/Км имеют симметричную колоколообразную форму. Что .касается параметра Км, то его рН-зависимость анализировать нет смысла, за исключением частного случая, рассмотренного в следующем разделе, когда эта зависимость очень проста.

6.4. Независимость Км от рН

При изучении рН-зависимости кинетических параметров ферментативных реакций довольно часто наблюдается такая картина, когда параметр V заметно изменяется при варьировании рН, в то время как Км остается постоянной. Постоянство Км можно рассматривать как доказательство того, что она является истинной константой равновесия [64], но подобное заключение едва ли можно считать очевидным и необходимо тщательно его аргументировать. Действительно, согласно уравнению (6.8), Км при К\ = К1 и Кт. = К2 перестает зависеть от рН, каковы бы ни были значения k_i и А+2. Однако это утверждение неверно, поскольку, как обсуждалось в предыдущем разделе, уравнение (6.8) получено для слишком простой модели. Чтобы исправить положение, необходимо включить в схему стадии присоединения субстрата к формам Н2Е и Еа_. Целесообразно также рассматривать стадии связывания отдельно от каталитических стадий, т. е. считать, что HES~rH HEP" представляют собой отдельные формы. Далее вполне естественно допустить, что характер протонирования важен только для второй, каталитической стадии, но не для стадий связывания, т. е. протоны не оказывают влияния на связывание субстрата или продукта и наоборот. В таком случае модель принимает следующий вид:

S+ НгЕ

К,

S+HE"

К,

S+E

HoES

:HES" ES2"

Ac-,

^+3

H2EP * I * H2E+P

HEP"

EP

2-

HE_+P A,

^-Ег-+Р

Для этого сложного механизма нетрудно вывести уравнение стационарной скорости, даже применяя метод Кинга—Альтмана (см. гл. 3), хотя при этом нужно рассмотреть не менее 384 деревьев. К счастью, вывод существенно упрощается, если принять, что

152

Глава 6

стадии протонирования — депротонирования протекают очень быстро по сравнению с другими стадиями, и воспользоваться в полной мере упрощениями, введенными в разд. 3.6. Уравнение скорости оказывается идентичным уравнению Михаэлиса—Ментен с У и Км, задаваемыми следующими выражениями:

у _ Кг Кз ер / (^)

(fc+S + fc-2)/№) + fc+3 '

Кк = -±-\к1+ *n<**-ii>/<*> 1, (6.Ц)

M fc+1 L (fc+2 +fc_s)/(fe)+ fc+3 J '

В этих выражениях /(Л) — функция Михаэлиса

nh)=lli~k+l+^r)- (6-12)

Из уравнений (6.10) и (6.11) можно найти условия, при которых V с изменением рН меняется, а Км остается постоянной. Эти условия таковы: либо к^ = /с^.либо к+2 очень мала. В каждом из этих случаев выражение для Км принимает простой вид: Км = = fc_1/fc+i, т. е. Км становится равной истинной константе диссоциации для комплекса HES-. Таким образом, приняв данную модель, мы смогли доказать исходное утверждение. Фактически такой же результат мы получим, рассматривая и более общую модель: если каталитическая реакция включает более трех стадий, то просто становятся более сложными алгебраические выкладки, если же принимается, что все константы диссоциации для кислот Н2Е, H2ES и НаЕР имеют различные значения, то найти условия, при которых /См не зависит от рН, не вводя в то же время гораздо менее правдоподобных допущений, очень трудно.

Интересно, что при = к+3 для выполнения равенства Км= k_Jk+i совсем не обязательно, чтобы константа скорости /с+2 была мала. На первый взгляд может показаться, что такое равенство констант очень маловероятно и не может быть предметом серьезного обсуждения. Вспомним, однако, что для многих метаболических реакций субстрат и продукт весьма близки по структуре и поэтому вполне могут связываться с ферментом в принципе одинаковым образом, а следовательно, константы скорости k_i и &+3 будут примерно одинаковы.

Наконец, необходимо провести детальное сопоставление уравнений (6.7) и (6.10). Уравнение (6.7) более удобно для описания экспериментальных данных, но зато уравнение (6.10), по-видимому, лучше отражает реальную ситуацию. Подставляя выражение (6.12) для f(h) в уравнение (6.10) и проведя преобразование, получаем

(6.10)

Влияние рН и температуры на ферменты

153

ah

2

М4

h

где а = k+al(k+z + &_а + Л+3). Из сопоставления этого уравнения с уравнением (6.7) видно, что все экспериментально измеряемые

параметры (V, К i и К 2) отличаются от соответствующих теоретических величин (fc+2e0, К\ и К J на неизвестный множитель а, т. е.

По определению а не может быть больше единицы, однако ничего другого об этой величине сказать нельзя. Далее, поскольку измеряемые константы диссоциации являются всегда молекулярными константами, а не константами, характеризующими ионизацию индивидуальных групп, встает вопрос, можно ли судить о стадиях протонировация фермента на основании измерений стационарных скоростей. Подобный скептицизм вполне оправдан, и при интерпретации экспериментальных данных по рН-зависимости кинетических параметров ферментативных реакций следует быть очень осторожными. Тем не менее почти во всех исследованиях эти зависимости интерпретируются в рамках модели, описанной в разд. 6.3, а измеряемые константы диссоциации обычно трактуются как константы, характеризующие ионизацию индивидуальных групп; до сих пор такие допущения не приводили к серьезным ошибкам при интерпретации рН-эффектов.

6.5. Ионизация групп, удаленных от активного центра

рН-эффекты для ферментативных реакций почти всегда обсуждаются в рамках моделей, предполагающих, что в молекуле фермента имеется лишь очень небольшое число ионогенных групп (часто только одна или две). Однако все ферменты содержат гораздо более чем две ионогенные группы, и поэтому возникает законный вопрос о том, обоснованно ли такое упрощение. Частично ответ на это дан уже в разд. 6.2: многие группы ионизируются в значительной степени только при значениях рН, лежащих за п