ределами рабочего интервала рН, и, следовательно, нх ионизация не осложняет картины. Остальные ионогенные группы могут быть разделены на три класса: 1) группы, непосредственно участвующие в каталитическом процессе или в связывании субстрата; 2) группы, принимающие участие в этих процессах косвенным образом (например, либо потому, что они близки к каталитическим группам, либо потому, что они участвуют в поддержании конформации молекулы фермента и для выполнения

ES ES /

= Я.

154

Глава 6

этой функции должны находиться в определенной ионной форме); 3) группы, которые удалены от активного центра и не оказывают практически никакого влияния на каталитическую активность. Любая более или менее реальная модель должна учитывать ионизацию групп первого класса и, как правило, второго. В тех случаях, когда число этих групп невелико, такая модель, позволяющая интерпретировать экспериментальные данные, достаточно проста. Группами третьего класса с полным основанием можно пренебречь. Это кажется очевидным, однако не следует рассматривать каждое непроверенное утверждение как очевидное и целесообразно показать его справедливость по крайней мере для простейшего случая.

Рассмотрим снова, как и в разд. 6.2, ионизацию двухосновной кислоты:

Допустим также, что ионизация двух групп происходит независимо друг от друга, т. е. K2i = Кц и /С22 = К12, и что ферментативная активность определяется ионизацией только одной из двух ионогенных групп. Например, ЕН_ и Е2" обладают одинаковой активностью, а НЕН и НЕ- неактивны. В этом случае активность пропорциональна ([ЕН-] + [Е2-]). Подставляя в уравнения (6.3) и (6.5) равенство Kzi = Кц и /С22 = Kis, получаем

[EH] + [Е2]

^11 КцК12^

+ h h? К„

Таким образом, в уравнение не входит больше константа Kiz, и рН-зависимость имеет точно такой же вид, как и для случая, когда ионизация второй группы не учитывается. Подобные упрощения возможны для всех моделей, в которых предполагается ионизация групп, не влияющих на ферментативную активность.

Влияние рН и температуры на ферменты

155

6.6. Смена одной лимитирующей стадии другой при варьировании рН

Для объяснения характера зависимости ферментативной активности от рН чаще всего используется подход Михаэлиса, в котором фермент рассматривается как двухосновная кислота; однако подобное объяснение не является ни единственным, ни даже самым простым. Альтернативный подход основан на использовании модели, рассматривающей только одну ионогенную группу, протонирование которой происходит на одной стадии реакции, а депротонирование — на другой. Например,

HES

Из этой схемы видно, что при очень высоких значениях'рН, когда концентрация формы НЕ бесконечно мала, связывание субстрата становится очень медленным и поэтому лимитирует скорость ферментативной реакции, а при очень низких значениях рН бесконечно малой становится концентрация формы ЕР и скорость реакции определяется скоростью высвобождения продукта. Скорость ферментативного процесса в целом в зависимости от рН должна поэтому представляться колоколообразной кривой, которая при экстремальных значениях рН стремится к нулю. К подобному выводу можно прийти и более строгим путем, рассмотрев уравнение скорости. Если стадии протонирования рассматривать как равновесные, скорость будет описываться уравнением Михаэлиса— Ментен с параметрами, зависящими от рН:

V = k+2KESe0I(KES+h),

М k+1h(KES + h)

V/KK = k+i К™ e0kf(k_t h + A+2 /CES)(/CE + h).

Нетрудно видеть, что зависимость V от рН представляет собой простой переход от нулевого значения до К?е0. Положение этого

Глава 6

перехода относительно оси рН определяется единственной константой ионизации KBS, соответствующей константе диссоциации кислоты HES; рН-зависимость VIКм является колоколообразной, как и в подходе Михаэлиса. Зависимость параметра Км от рН, как и ранее, имеет сложный Вид, и ее нецелесообразно анализировать отдельно.

Если стадии протонирования не являются равновесными, то для рассматриваемого механизма, представляющего собой простой механизм с образованием тройного комплекса и упорядоченным присоединением субстратов и с водородными ионами в качестве как первого субстрата, так и первого продукта, уравнение скорости имеет еще не очень сложный вид. Так, можно воспользоваться выведенным для подобного механизма уравнением (5.2), изменив соответствующим образом обозначения. Строгий анализ показывает, что зависимость параметра V (так же как и VIКм) представляется графически колоколообразной кривой.

6.7. Температурная зависимость ферментативных реакций

Теоретические подходы, использованные в разд. 1.6 и 1.7 для объяснения температурной зависимости обычных химических реакций, в принципе применимы и к ферментативным реакциям. Однако на практике при изучении влияния температуры на скорость ферментативных реакций возникает целый ряд осложнений, о которых всегда нужно помнить, проводя подобные исследования. Прежде всего, почти все ферменты при температурах, заметно превышающих физиологические, денатурируют. При этом происходит изменение конформации молекулы фермента (часто необратимое) с одновременной потерей каталитической активности. По своей химической природе денатурация представляет собой очень сложный процесс и не получила еще полного объяснения. В данной книге этот вопрос рассмотрен в упрощенном виде. Будем считать процесс денатурации полностью обратимым и допустим, что в любой момент времени существует равновесие между активной и денатурированной формами фермента, причем денатурированный фермент представлен единственной формой.

При денатурации не происходит разрыва ковалентных связей, рвутся лишь водородные и другие слабые связи, участвующие в стабилизации конформации фермента, соответствующей активной форме. Хотя все эти связи существенно слабее ковалентных (энергия водородной связи составляет 20 кДж • моль -1, в то время как энергия ковалентной связи равна приблизительно 400 кДж - моль-1), следует учитывать, что денатурация обычно сопровождается разрывом большого числа слабых связей. Поэтому стандартное изменение энтальпии (АЯ°) для реакции денатура-

Влияние рН и температуры на ферменты 157

ции, как правило, достаточно велико (200—500 кДж • моль-1). Однако разрыв большого числа водородных связей существенно ловышает число конформационных состояний молекулы фермента, вследствие чего денатурация характеризуется также очень большим стандартным изменением энтропии (AS°).

Влияние денатурации на экспериментально наблюдаемые константы скорости ферментативной реакции можно показать, рассмотрев следующую простую реакцию:

Е'

Ч «k

Е + S -у Е + Р..

Здесь активный фермент Е находится в равновесии с неактивной формой Е', а каталитический процесс представлен простой реакцией второго порядка, как это обычно имеет место при очень низких концентрациях^ субстрата. Зависимость константы равновесия (К) для процесса денатурации от температуры описывается уравнением Вант-Гоффа (разд. 1.6)

—'RT In К = AG" = ДЯ° — TAS°,

где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, AG", АН° и AS° — стандартные изменения свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии соответственно для процесса денатурации. Отсюда константу равновесия можно выразить следующим образом:

К = exp (AS°/R — AH°/RT).

Зависимость константы скорости к от температуры подчиняется уравнению Аррениуса, представленному в интегральной форме:

к = Лехр (— EJRT),

где а — константа и еа — энергия активации. Скорость реакции определяется выражением y=ME][S], в котором концентрацию активного фермента [Е] необходимо выразить через полную концентрацию фермента е0. В результате получаем

v = ke0s/(l + К).

Наблюдаемую константу скорости /е„а6л можно записать как /с/(1 + К); она изменяется с температурой по следующему закону:

к = Aexyj-EJRT) набл 1 + exp (&.S°/R — ДЯ°/ДГ) *

При низких температурах, когда величина AS°/R мала по сравнению с AH°/RT, вклад экспоненциального члена в знаменателе является несущественным, и поэтому зависимость й;набя от темпе-

158

Глава 6

ратуры описывается обычным уравнением Аррениуса. Однако при температурах выше чем &H;°/AS° знаменатель очень быстро растет с увеличением температуры, в результате чего скорость резко падает до нуля.

Хотя эта модель является весьма упрощенной, она объясняет, почему уравнение Аррениуса оказывается неприменимым для описания температурной зависимости ферментативных реакций при высоких температурах. В ранних работах по ферментативной кинетике обычно приводился такой параметр, как оптимальные температуры для ферментов. Однако следует отметить, что температура, при которой &набл достигает максимального значения, с практической точки зрения не имеет особого смысла, поскольку, как оказалось, характер температурной зависимости ферментативных реакций зависит от постановки эксперимента. В частности, чем дольше инкубируется реакционная смесь перед определением активности, тем ниже наблюдаемая «оптимальная температура». Объясняется это тем, что денатурация, как правило, протекает довольно медленно, и, следовательно, эту стадию нельзя рассматривать как равновесную. Степень денатурации растет с увеличением времени инкубации, что нетрудно обнаружить современными экспериментальными методами: при непрерывной регистрации ферментативной реакции выявляются протекающие во времени процессы.

Из-за трудностей, связанных с денатурацией, исследования температурной зависимости скорости ферментативных реакций обычно дают надежные результаты только в относительно небольшом интервале температур (например, между 0 и 50°С). Однако даже в этом случае при интерпретации данных следует соблюдать известную осторожность. Вряд ли имеет смысл изучать температурные зависимости параметров V, V/Км или Км, если неясен их физический смысл. Так, если Км является функцией нескольких констант скорости, то температурная зависимость этого параметра будет определяться сразу многими факторами и поэтому не будет представлять особого интереса. Однако если с достаточной достоверностью известно, что Км представляет собой истинную ко