нстанту диссоциации, то из температурной зависимости параметра Км можно получить данные о термодинамике процесса связывания субстрата ферментом. Аналогичным образом температурная зависимость параметра V представляет интерес только в том случае, если известно, какую стадию ферментативной реакции этот параметр характеризует.

Другое обстоятельство, которое следует иметь в виду, состоит в том, что влияния рН и температуры не являются в общем случае независимыми, поскольку, как правило, константы ионизации зависят от температуры. Ясно поэтому, что, прежде чем интерпретировать результаты исследований, проведенных при различ-

Влияние рН и Температуры на ферменты

159

ных температурах, необходимо ввести соответствующие поправки, учитывающие рН (разд. 6.3). В связи с этим важно помнить также," что константа ионизации воды (isTw) сильно зависит от температуры и pKv (т. е. —lgKw) равен 14,0 только при 24°С, а при температуре 37°С, часто используемой при изучении ферментативных реакций, p/?w = 13,62, и поэтому нейтральный рН равен 6,8, а не 7,0. С повышением температуры отклонения становятся еще большими. Это обстоятельство исключительно важно при изучении реакций, в которых ионы ОН" принимают непосредственное участие, в особенности при сопоставлении ферментативных реакций с реакциями, катализируемыми основаниями.

6.8. Использование температурного фактора для изучения специфичности фермента

В предыдущем разделе мы потратили очень много усилий на то, чтобы предостеречь читателя от поверхностного изучения температурной зависимости скоростей ферментативных реакций. Было бы ошибочным считать, однако, что такие исследования бесполезны; напротив, при соблюдении необходимых мер предосторожности они могут дать весьма ценную информацию о механизме ферментативной реакции. Подобный подход является особенно плодотворным при изучении специфичности фермента. Если достоверно известно, что сопоставляемые величины подобны (например, сравнение констант ккат, т. e7Vle0, для двух субстратов будет корректным только в том случае, когда для каждого из субстратов &кат относится к одной и той же стадии реакции), то сопоставление параметров д Н* и часто оказывается гораздо более информативным, чем сопоставление простых констант скорости. Классическим исследованием подобного типа может служить работа, проведенная Бендером, Кезди и Гантером [10] по изучению катализируемого ос-химотрипсином гидролиза многочисленных субстратов. Считается, что для этой реакции выполняется механизм с образованием ацилферменпга, т. е. механизм с замещением фермента, в котором сначала субстрат RCO—X ацилирует фермент НЕ:

RCO—X + НЕ ^ (RCO—X • НЕ) ^ RCO—Е + НХ,

fc-i

с одновременным высвобождением первого продукта НХ, а затем ацилфермент RCO—Е реагирует с водой; на второй стадии происходит регенерация свободного фермента и отщепление второго продукта RCO—ОН:

RCO—Е + НаО ^ RCO—ОН + НЕ.

160

Глава 6

Поскольку для одних субстратов (в частности, в данном случае) k+i .^к+3, а для других к+2 <§С" &+з> прямое сопоставление величин &кат, очевидно, бессмысленно. Однако Бендер, Кезди и Ган-тер, сравнивая результаты, полученные с различными субстратами, смогли провести раздельное определение констант &+2 и к+3. Например, серия эфирных производных ацетил-Ь-тирозина характеризуется одинаковым значением й;кат, которое отличается от значения й;кат для аналогичной серии производных ацетил-L-триптофана. Это означает, что для этих субстратов к+2^> /е+3 и &кат = к+3. Таким образом, авторы измерили значения к+3 для ряда ацилхимотрипсинов при различных температурах и обнаружили большие различия между производными специфических субстратов (таких, как ацетил-Ь-тирозилхимотрипсин) и производными неспецифических субстратов (таких, как ацетил-' химотрипсин). Отчасти эти вариации могут быть обусловлены различиями в реакционной способности самих ацильных групп, имеющей неферментативную природу. Для того чтобы учесть этот фактор, Бендер, Кезди и Гантер разделили каждое значение -к^ на константу скорости процесса омыления (т. е. гидролиза, катализируемого гидроксильными ионами) соответствующих этиловых эфиров. Скорректированные значения й:+3 и рассчитанные из температурной зависимости этого параметра величины АН* и AS* представлены в табл. 6.2.

Таблица 6.2

АКТИВАЦИОННЫБ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА НЕКОТОРЫХ АЦИЛХИМОТРИПСИНОВ [10]

Ацильная группа

Относитель-ное значение *+з (скорректированное)

Ф АН, кДж-моль-1

ф

AS , Дж-ыоль-'-град-'

Ацетил-Ь-тирозильная 3540 43,3 —56,3

Ацетил-L-триптофаяильная 942 50,4 —83,2

тракс-Цивнамоильная 15 47,0 —124,3

Ацетильная 1 40,7 —150,8

Наиболее, удивительным в этих данных оказалось отсутствие какой-либо заметной корреляции между к+3 и АН*. Действительно, величина ДН* меняется незначительно, и, по-видимому, энергетический фактор не играет существенной роли на стадии деаци-лирования. Изменение к+3 почти целиком обусловлено изменением в широком диапазоне величины д S*. Это означает, что скорость реакции определяется в основном вероятностью того, что ацильная группа примет правильную ориентацию в активном центре. Для больших по размеру специфических групп (например, для ацил-

Влияние рН и температуры на ферменты

161

L-тирозильной группы) число возможных ориентации ограничено, и поэтому вероятность правильной ориентации довольно высока. В случае же неспецифических групп небольшого размера существует очень много возможных ориентации, вследствие чего вероятность правильной ориентации оказывается гораздо меньшей. Следует отметить, что подобные заключения о специфичности химо-трипсина были сделаны на основании сопоставления ацилхимо-трипсинов, полученных из L- и D-аминокислот [83] (разд. 4.8).

Глава 7

Контроль ферментативной активности

7.1. Необходимость контроля метаболических процессов

Очевидно, что метаболические процессы во всех живых организмах должны очень четко контролироваться, чтобы обеспечить строго направленные изменения, избежав при этом катастрофического срыва в направлении к состоянию термодинамического равновесия. Однако ферменты, имеющие рассмотренные в предыдущих главах кинетические свойства, вряд ли способны в должной мере обеспечить подобный контроль. Имеет смысл поэтому предварительно обсудить одну из важных стадий метаболизма — взаимное превращение фруктозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифос-фата—и выяснить, какими кинетическими свойствами должны обладать «регулируемые» ферменты. Для превращения фруктозо-6-фосфата в фруктозо-1,6-дифосфат требуется АТФ:

Фруктозо-6-фосфат + АТФ->- Фруктозо-1,6-дифосфат 4- АДФ.

Это превращение катализируется фосфофруктокиназой и представляет собой первую стадию гликолиза, которая присуща только этому процессу, иначе говоря, это стадия гликолиза, которая не входит ни в какие другие метаболические процессы. Стадия превращения фруктозо-6-фосфата в фруктозо-1,6-дифосфат вполне может поэтому контролировать весь процесс гликолиза и, несомненно, является его ключевой стадией. В физиологических условиях эта реакция практически необратима, и в глюконеоге-незе обратная реакция протекает обходным путем, а именно путем гидролиза фруктозо-1,6-дифосфата, катализируемого фруктозо-дифосфатазой:

Фруктозо-1,6-дифосфат + Н20-->¦

—->- Фруктозо-6-фосфат + Неорганический фосфат.

Эта реакция также практически необратима. Факт одновременного существования двух необратимых реакций имеет для метаболического контроля Огромное значение: он означает, что направление потока может контролироваться активностями двух ферментов. Простая обратимая реакция не могла бы контролироваться подобным образом, потому что катализатор не способен влиять на направление потока реагирующих веществ, которое определяется исключительно термодинамическими факторами.

Контроль ферментативной активности

163

Если бы обе реакции протекали неконтролируемым образом с одинаковыми скоростями, то суммарный поток между фруктозо-6-фосфатом и фруктозо-1,6-дифосфатом оказался бы равным нулю, однако при этом должен был бы происходить непрерывный гидролиз АТФ, что неминуемо ведет к смерти. Подобная совокупность реакций названа «бесполезным циклом». Воспрепятствовать протеканию бесполезного цикла можно либо пространственным разделением двух процессов, либо обеспечением такого контроля, при котором активность одного из ферментов возможна только при подавлении активности другого. В какой-то степени контроль достигается компартментализацией, однако в таких тканях, как почка и печень, где может происходить и гликолиз и глюконеогенез, подобный путь невозможен, и поэтому здесь необходим определенный контроль активности фосфофруктокиназы и фруктозодифосфатазы.

Рассмотрим теперь вопрос о том, возможен ли достаточно точный контроль активности фермента, свойства которого подчиняются обычным законам ферментативной кинетики, в частности следуют уравнению Михаэлиса — Ментен v = Vs/(Khl-\-s). Простой расчет показывает, что в этом случае для увеличения скорости от 0,1 V до 0,9 V необходимо повысить концентрацию субстрата от Ам/9 до 9Kuj т. е. в 81 раз. Заметим, что речь идет об относительно небольшом увеличении скорости. Аналогичным образом если для какого-либо фермента выполняется уравнение, характерное для простого конкурентного ингибирования, v = Vsl[KM(l + i!Kt) + s], то для снижения скорости от 90 до 10% уровня активности в отсутствие ингибитора необходимо повысить концентрацию ингибитора в 81 раз. Если изменения концентраций ингибитора и субстрата происходят согласованно, то можно получить более быстрое изменение скорости реакции. Например, для приведенного выше уравнения 9-кратного увеличения v (от F/13 до 9F/13) можно добиться увеличением s от Ам/3 до ЗКи и одновременным уменьшением i от 3Kt до /С*/3. Однако даже для случая, когда несколько эффекторов действуют согласованно, качественная картина остается прежней: для того чтобы добиться даже небольшого изменения скорости, необходимы существенные изменения состава окружающей среды. В то же время к метаболизму предъявляются совершенно противоположные требования