: с одной стороны, концентрации основных метаболитов должны поддерживаться в довольно узких интервалах, а с другой — должна существовать возможность изменения скоростей реакций в широких пределах (по-видимому, изменения должны быть большими, чем те, которые многократно обсуждались выше, а именно от 0,1 V до 0,9F) в ответ на очень небольшие изменения концентраций метаболитов.

Совершенно ясно, что обычные законы ферментативной кине-

164

Глава 7

тики не могут обеспечить такой контроль активности ферментов, который необходим для регуляции метаболизма. Напротив, многие ферменты, занимающие ключевые позиции в метаболических путях, обладают исключительно высокой чувствительностью к изменениям концентраций метаболитов. Это свойство ферментов обычно называют неоперативностью, потому что предполагается, что во многих случаях оно связано с кооперативным взаимодействием активных центров в молекулах полимерных ферментов1. В этой главе рассмотрены основные теории, предложенные для объяснения кооперативности.

Реакция взаимного превращения фруктозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата может служить иллюстрацией еще одного важного аспекта метаболического контроля. Продукт этой реакции и конечный продукт гликолитической цепи различаются между собой. Действительно, в реакции, катализируемой фосфофрук-токиназой, АТФ выступает в роли субстрата,, в то время как функцией гликолиза в целом, если его рассматривать как путь, ведущий к циклу трйкарбоновых кислот и транспорту электронов-•является «наработка» больших количеств АТФ. Таким образом, АТФ следует считать продуктом гликолиза, несмотря на то что он является субстратом реакции, контролирующей скорость гликолиза. Поэтому обычное ингибирование фосфофруктокиназы продуктом, АДФ, приводит к эффекту, обратному желаемому: для того чтобы обеспечить стационарное снабжение энергией, фосфофруктокиназа должна ингибиро-ваться конечным продуктом цепи, АТФ, что и наблюдается в действительности. Подобный тип ингибирования не может быть реализован на основе обычных механизмов, т. ё. путем связывания ингибитора, являющегося структурным аналогом субстрата. В одних случаях такие ингибиторы могут вызывать нежелательный эффект, а в других конечный продукт цепи может иметь незначительное структурное сходство с любым из участников стадии, которая является контролирующей (например, L-гистидин имеет очень мало сходства со своим предшественником в биосинтетической цепи — фосфорибозилпирофосфатем). Ингибирование или активация соответствующими метаболическими эффекторами возможны благодаря тому, что во многих регулируемых ферментах имеются центры связывания эффектора, которые пространственно удалены от каталитических центров. Эти центры названы

1 Поскольку свойство повышенной чувствительности к варьированию концентрации метаболита не всегда отражает кооперативное взаимодействие центров, связывающих метаболит в молекуле фермента, более удачным следует ¦считать термин «кинетическая кооперативность». Кинетическая кооперативность (положительная, как в обсуждаемом случае, или отрицательная) является характеристикой отклонений от простых кинетических законов типа Михаэлиса — Ментен (см. Б. И. Курганов, Аллостерические ферменты, «Наука». М., 1978, стр. 28, 35). — Прим. перев.

Контроль ферментативной активности

165

аллостперическими (от греческих слов аХХо? —другой и отереос — пространственный), с тем чтобы подчеркнуть структурное различие между субстратом и эффектором, а ферменты, имеющие подобные центры, названы аллостерическими ферментами.

Многие ферменты, активность которых регулируется по аллостерическому механизму, обнаруживают также и кооперативную кинетику. Верно и обратное, поскольку оба свойства — аллостерический контроль активности и повышенная чувствительность к изменению концентрации матаболита — имеют большое значение для метаболического контроля. Однако это не означает, что данные термины эквивалентны: они описывают различные свойства и должны быть четко разграничены. Во многих случаях установление этих свойств происходило раздельно: для гемоглобина, например, кооперативный характер связывания кислорода был установлен более чем- за 60 лет до открытия аллостери-ческого эффекта 1,2-дифосфоглицерата; то, что первый фермент биосинтеза гистидина является аллостерическим, известно уже давно, однако кооперативных кинетических эффектов для него не обнаружено.

7.2. Связывание кислорода гемоглобином

Несмотря на то что гемоглобин является не ферментом, а белком-переносчиком, было бы нелепо говорить о кооперативности, не рассмотрев предварительно свойств этого белка. Во-первых, его коопе-ративность была установлена задолго до обнаружения подобных свойств у какого-либо фермента (Бор, 1903 г. [15]), и большая часть попыток создания теорий, объясняющих это явление, была направлена именно на выяснение природы кооперативности у гемоглобина. Во-вторых, связывание кислорода гемоглобином может быть непосредственно измерено в равновесных условиях, и, следовательно, отпадает необходимость во введении не очень обоснованных допущений о соотношении между равновесным связыванием и связыванием в стационарных условиях. В-третьих, гемоглобин в отличие от большинства ферментов, обнаруживающих неоперативность, достаточно стабилен и может быть получен в больших количествах, поэтому является очень удобным объектом для проведения экспериментов и изучен достаточно подробно. Наконец, наряду с гемоглобином существует миоглобин — аналог, который не проявляет кооперативных свойств и служит для запасания кислорода в мышце. Это позволяет проводить прямое сопоставление, что невозможно ни в^ каком другом случае. -

Связывание лиганда X простым мономерным белком Е может быть представлено как

Е + X =i* ЕХ,

166

Глава 7

i

где К — константа ассоциации. Концентрация комплекса в равновесных условиях равна

[ЕХ] = Л;[Е][Х]. . (7.1)

Сделаем здесь небольшое отступление для уяснения системы обозначений. Необходимо обратить внимание на два главных различия между символами, использованными в настоящей главе, с одной стороны, и символами, употребляющимися в других разделах книги, — с другой. Во-первых, при интерпретации данных равновесных исследований, особенно в случае гемоглобина, обычно пользуются константами ассоциации, а не более привычными для биохимиков константами диссоциации. Это упрощает вид многих уравнений. В то же время основополагающая теория кооперативности, симметричная модель Моно, Уаймена и Шанжё (разд. 7.7), обсуждается всегда в терминах констант диссоциации. Тем не менее попытка избежать существующей путаницы путем перевода литературных данных в другую систему обозначений еще больше запутала бы картину. Во-вторых, рассматривая вопросы кооперативности, мы не будем использовать символы-сокращения для обозначения концентраций (например, х для X), поскольку применять зту систему для концентраций более сложных соединений, таких,, как ЕХ4, неудобно, а также потому, что в равновесных опытах общая концентрация белка по порядку величины часто совпадает с общей концентрацией лиганда и в результате концентрация свободного лиганда может быть намного меньше общей концентрации лиганда, в то время как в стационарной кинетике картина обычно обратная.

Обозначим через Y степень насыщения белка лигандом, т.е. долю'связывающих центров, занятых лигандом в любой момент времени. По определению

Y_ Число занятых связывающих центров _ [ЕХ]

Общее нисло связывающих центров [Е] 4- [ЕХ]

Из уравнения '^(7.1) получаем

у = —Щ\- (7 2)

Это уравнение представляет собой изотерму Лэнгмюра (разд. 2.2) и в координатах {Y; [X]} представляется равнобочной гиперболой, проходящей через начало координат и асимптотически приближающейся к прямой Y = 1. Таким образом, это уравнение очень близко к уравнению Михаэлиса — Ментен (учитывая смысл величин Км и V, мы должны при переходе к последнему уравнению заменить 1/К на Ки и 1 на V).

Контроль ферментативной активности

167

Экспериментально измеренная степень насыщения миоглоби-на в зависимости от парциального давления кислорода, конечно, описывается уравнением (7.2). Однако результаты аналогичных опытов с гемоглобином укладываются на совсем иную, необычную кривую — сигмоидную, или S-образную, изображенную на рис. 7.1. Уравнение (7.2) не позволяет объяснить форму этой кривой,

1,0 г

12 3 4

[X], произвольные единицы

Рис. 7.1. Сопоставление гиперболической (/) и сигмоидной (ii) кривых.

и начиная с 1910 г., после опубликования статьи Хилла [75], предпринимались многочисленные попытки построить физическую модель, объясняющую S-образный характер функции насыщения гемоглобина кислородом.

Прежде чем приступить к рассмотрению предложенных моделей кооперативности, полезно обратить внимание на значительные различия в структуре миоглобина и гемоглобина. Миоглобин — мономерный белок, молекула которого состоит из единственной полипептидной цепи и содержит один центр, связывающий кислород. Гемоглобин же — тетрамерный белок, его молекула состоит из четырех полипептидных цепей (или субъединиц), и каждая из них имеет центр, связывающий кислород. Молекула гемоглобина образована субъединицами двух типов (две а-субъединицы и две Р-субъединицы), однако они сходны по структуре как между собой, так и с миоглобином, поэтому в первом приближении гемоглобин можно рассматривать как тетрамер, составленный из четырех молекул миоглобина. Ретроспективное рассмотрение показывает, что различия двух белков в отношении связывания кислорода

168

Глава 7

обусловлены различием в их олигомерном состоянии. Следует отметить,.однако, что подробная информация о структуре миоглоби-на и гемоглобина была получена относительно недавно [87, 125], и первые исследователи кооперативных эффектов при связывании кислорода не располагали сведениями о структуре этих белков.

7.3. Уравнение Хилла

В 1910 г. Хилл [75] поставил перед собой задачу объяснить расхождение в значениях молекулярного веса гемоглобина, полученных им и рядом других исследователей. Хилл предположил, что мономерный гемоглобин в присутствии со