лей ассоциирует и что в определенных условиях степень ассоциации можно охарактеризовать по способности связывать кислород. Если каждый полимер Ед связывает h молекул лиганда, причем реакция протекает в одну стадию, т. е.

Eh + hX^EhXh,

то концентрация комплекса ЕА Хд определяется соотношением

D34XJ = tf4py[X]\ (7.3)

где Kh — соответствующая константа ассоциации. Для раствора, содержащего смесь мономеров Ех(й =1) и димеров (h =2), зависимость степени насыщения Y от равновесной концентрации лиганда имеет следующий вид:

ХЛГ2[ХР (1-Х) 1+Яа[Хр i + k^x) '

где % и (1 .— ^,) — доля белка (по весу), находящегося соответственно в димерной и мономерпой формах. Хилл показал, что полученные к тому времени данные по связыванию кислорода гемоглобином в пределах ошибки измерения описываются этим уравнением, но он понимал, что ограничиваться рассмотрением только мономерной и димерной форм нет никаких оснований. Более реальной, по мнению Хилла, была бы модель, включающая олигомеры большего размера. Однако такая модель приводила ,к слишком сложному уравнению. Поэтому Хилл предложил использовать для описания экспериментальных данных чисто эмпирическое уравнение1

Y = Khlx]h п 4)

i + kh[x]» ¦

1 Заметим, что величина у ^ представляет собой концентрацию полунасыщения [Х]о.5, т. е. концентрацию X, при которой У=0,5. — Прим. перев.

Контроль ферментативной активности

169

Это уравнение может быть получено из уравнения (7.3), если допустить, что белок существует только в двух формах, Ед и EftXft. Хилл показал, что при помощи уравнения (7.4), известного теперь как уравнение Хилла, можно очень точно описать все полученные к тому времени экспериментальные данные, используя значения h в интервале от 1,0 до 3,2. Преобразуем уравнение^(7.4) следующим образом:

¦1g(73F) = lg/Cft + fcIg[X]- "(7-5)

Рис. 7.2. График Хилла.

Прямая проведена в соответствии с уравнением Хилла [уравнение (7.5)]. За исключением области ^вблизи lg [К/(1 — Y)\ = 0, точки не ложатся строго на прямую. Следует отметить, что, как правилт, провести измерения вне интервала значений lg [К/(1 — К)] {—1; + 1} довольно трудно (этот интервал соответствует значениям Y от 0,09 до 0,91).

Тогда зависимость lg[T7(l — Y)\ от lg[X] графически будет представлена'прямой с наклоном, равным п. Подобный график назван графиком Хилла (рис. 7.2); с его помощью можно легко определить параметры h и Kh. Оказалось, что график Хилла удивительно хорошо описывает множество данных по связыванию кислорода гемоглобином для значений У в области от 0,1 до 0,9. Однако при экстремальных значениях Y всегда наблюдаются отклонения (как это видно на рис. 7.2), поскольку уравнение (7.4) в лучшем случае является лишь аппроксимацией какого-то более сложного выражения.

170

Глава 7

Хилл, проявляя осторожность, не вкладывал в параметры КЛ и h никакого физического смысла. Однако многие современные исследователи полагают, что h должен быть равен числу субъединиц п в полностью ассоциированной форме фермента, и поэтому часто недоумевают по поводу того, что h, как правило, не является целым числом и редко бывает равным п. В то же время совершенно ясно, что нет никаких оснований считать h целым числом, а потому не стоит удивляться, если оно им не оказывается. По причинам, которые мы рассмотрим в следующем разделе, h не может превышать и, т. е. измеряемое значение h дает нижний предел величины п.

Показатель степени h называют обычно коэффициентом Хилла. Он широко используется как параметр, характеризующий степень кооперативности: чем больше значение h, тем она выше. Такета и Погелл [141] предложили для характеристики кооперативности другой параметр, показатель кооперативности Rx, определяемый как отношение значений [X], необходимых для получения значений Y, равных 0,1 и 0,9. Таким образом, Rx имеет более ясный смысл, чем h, и является более удобным параметром для оценки связи свойств кооперативных белков с их физиологической ролью. Дополнительное преимущество показателя Rx состоит в том, что он является чисто эмпирической величиной и не связан ни с какой теоретической моделью, которая всегда в той или иной степени является приближенной. Чтобы получить соотношение между двумя параметрами, нужно подставить значения Y = 0,1 иУ = 0,9 в уравнение (7.4) и найти в каждом случае [X]:

Rx = 8iUH.

это соотношение выполняется, конечно, не с большей точностью, чем уравнение (7.4), однако для большинства задач оно оказывается вполне пригодным. Некоторые значения Rxuh, рассчитанные при помощи выведенного соотношения, представлены в табл. 7.1.

' 7.4. Уравнение Эдера

После того как было показано, что молекулярный вес гемоглобина приблизительно в 4 раза больше, чем думали раньше, Эдер [1, 2] предположил, что молекула гемоглобина содержит четыре центра, связывающих кислород, и что заполнение этих центров происходит не согласованно, как полагал Хилл, а поста-дийно:

Е + X ЕХ, j к,

EX + X ^zz± ЕХ2,

Контроль ферментативной активности

171

Таблица 7.1

соотношение между двумя показателями кооперативности. в таблице приведены соотношения между коэффициентом хилла ft и показателем кооперативности Цх. введенным такетоя и погеллом

[141]. значения н и нх рассчитаны в предположении строгой выполнимости уравнения хилла

А *х Качественная характеристика

0,5 6560

0,6 1520

0,7 533 Отрицательная кооперативность

0,8 243

0,9 132

1,0 81,0 Отсутствие кооперативности

1.5 18,7

2,0 9,00

2,5 5,80

3,0 4,33

3,5 3,51

4,0 3.00 Положительная кооперативность

5,0 2,41

6,0 2,08

8,0 1,73

10 1,55 -

15 1,34

20 1,25

3

ЕХ2 -|- X -<—— ЕХа, 1

ЕХ3 + X ЕХ4.

Константы Ки К2, К3 и КА в этой схеме являются микроскопическими (intrinsic), а не молекулярными константами ассоциации, и если четыре связывающих центра идентичны и действуют независимо друг от друга, то должно выполняться равенство Кг = = Кг = К3 = КА.

Для модели Эдера концентрации комплексов определяются следующими выражениями:

[ЕХ] = 4/(1[Е][Х],

[ЕХ2] = -|- Кг [EX] [X] = 6/С, К2 [Е] [X]2,

(7.6)

172

Глава 7

[ЕХ3] = Atfe[EXa][X] = ^КшКа[Щ[ХГ, [EXJ = --j-/f4[EX3][X] = Я, *,*,**[Е]ГХ]«.

(7.6)

Используя эти соотношения, нетрудно получить уравнение для степени насыщения:

v_ Число занятых центров _

Общее число связывающих центров

= [ЕХ] + 2 [ЕХа] + 3 [ЕХ3] + 4 [EXJ _ 4([Е] + [ЕХ] + [ЕХ2] + [ЕХ3] + [ЕХ4]) = *i [X] + ЗКг К2 [X]* + 3*! К2 К3 [ХР + Кг К2 К3 Kt [X]* ,? ?

1 + Шу [X] + 6кг К2 [Х]з + Шу К2 К3 [Х]з + Kt К2 К3 ЛГ4 [X]* '

Это уравнение известно как уравнение Эдера для четырех центров. (Аналогичные уравнения могут быть получены таким же путем для любого числа центров.) Если все четыре микроскопические константы ассоциации равны между собой, то уравнение Эдера существенно упрощается:

у = КХ[Х] (i+K^X])* = Kt[X] {1 g

(l + rTxlX])* ' i+Kt[X] •

Оно принимает вид уравнения (7.2), которое представляет собой уравнение гиперболы. Поскольку функция насыщения гемоглобина кислородом же является гиперболой, четыре константы ассоциации в случае гемоглобина не могут быть идентичными.

Если константа КЛ очень велика по сравнению с Klt К2 и K3t то уравнение (7.7) сводится к виду

V ^1К2 Ks Кц [X]4

т. е. представляет собой уравнение Хилла с Kh = КХК2К3К^ и h = 4. Следует отметить, что уравнение (7.7) ни при каких допущениях не может быть преобразовано в уравнение Хилла с коэффициентом Хилла, большим 4. Кроме того, если [X] достаточно мала, то независимо от значений констант ассоциации величина КХ[Х\ станет в конце концов больше членов уравнения (7-г7), содержащих [X] в степени 2 и выше. Поэтому при очень малых значениях [X] уравнение (7.7) упрощается:

v Kt[X]

1+ 4ЛГЛХ]

Следовательно, уравнение (7.7) дает график Хилла, в котором наклон (т. е. К) при [X] -»-0 приближается к 1. Аналогичным обра-

Контроль ферментативной активности

173

зом h и при IX] -*- со. Резюмируя, можно сказать, что в общем случае при любых значениях констант ассоциации коэффициент Хилла должен приближаться к единице при экстремальных значениях IX] и не может превышать числа связывающих центров при промежуточных значениях [X].

Модель Эдера является самой общей из возможных моделей связывания лиганда «чистым» неассоциирующим белком в равновесных условиях. Под «чистым» белком понимается белок, способный находиться в различных изомерных формах, равновесие между которыми устанавливается очень быстро; кроме того, подразумевается, что изомеризация не включает процессы диссоциации—ассоциации белка. Рассмотрим модель Эдера для белка, содержащего четыре связывающих центра на молекулу и представленного двумя находящимися в равновесии формами — активной (Е) и неактивной1 (Е'):

Е^Е'; [Е'] = /Г0[Е]. В этом сл учае функция насыщения имеет следующий вид: у = _[ЕХ] + 2 [ЕХг] + 3 [ЕХ3] + 4 [ЕХ4]____

4([Е] + [Е'] + [ЕХ] + [ЕХ2] + [ЕХ3] + [ЕХ4])

кх [X] + жгк2 [хр +жгк2кв [Х]з + к^к^ [X]* (79)

Если каждый член этого уравнения поделить на (1 + К0), то, как нетрудно видеть, оно совпадет по виду с уравнением Эдера. Действительно, если заменить в уравнении (7.7) Кг на KJ{i + + jRT0). то мы получим уравнение (7.9). К аналогичному результату мы придем и в том случае, если к изомеризации способна какая-либо другая или все формы фермента (ЕХ, ЕХ2 и т. д.). Таким образом, изомеризация не влияет на характер зависимости степени насыщения от концентрации лиганда, и наоборот, рассматривая только характер* функции насыщения, нельзя сделать никаких выводов о наличии или отсутствии изомеризации.

Если Е' не находится в равновесии с Е, то результат получается иной. В этом случае зависимость Y от IX] имеет следующий вид:

у = К, [X] + ЗКгК2 [X]" + ЗК^Кз [Х]з + [X]*_

([Е']/[Е]+1)+4Х1[Х]-г- 6КХК2 [X]* + Ш^Кз [Х]з + К.К^К, [X]'

Это уравнение не аналогично уравнению (7.7): деление всех его членов на ([Е']ЛЕ] + 1) не эквивалентно делению на (1 + Кв) членов уравнения (7.9), потому что [Е] не является константой, не зависящей от [X].