1 Имеется в виду неспособность связывать лиганд, — Прим. перев.

174

Глава 7

В более общем случае, когда в растворе присутствует смесь белков, различающихся по сродству к лиганду, функция насыщения принимает очень сложный вид и содержит члены до [Х]?Л, где 2п — полное число связывающих центров различного сорта. Поскольку это уравнение совпадает по форме с уравнением Эдера для чистого белка с Ни связывающими центрами, можно было бы ожидать, что такая смесь будет обнаруживать большую кооперативность, чем любой из чистых белков, входящих в ее состав. Однако на самом деле это не так: интуитивно ясно, что если взаимодействие между связывающими центрами отсутствует, то лиганды будут наиболее сильно связываться с центрами, имеющими к ним наибольшее сродство. И хотя функции насыщения для смесей белков обнаруживают отклонения от соответствующих функций для чистых белков, эти отклонения всегда направлены в сторону усиления отрицательной кооперативности, т. е. в сторону увеличения Rx или уменьшения коэффициента h.

Из всего сказанного следует, что присутствие в выражении для степени насыщения членов, содержащих [X] в степени 2 и выше, вовсе не означает, что функция насыщения позволит выявить кооперативность. Чтобы показать это более строго, рассмотрим уравнение Эдера для белка, содержащего два связывающих центра:

У ^[Xl + JC^IXP

i+2K1[X] + K1K2[X]* '

Из этого уравнения нетрудно получить, что

lg(_Z_) = 1^1 + lg[x] + Ig(-l±ii|L).

Дифференцируя по [X], приходим к следующему выражению для h:

ft_l I (X-.-X"i)[X]

(1+x-tixiHi + x.iX]) *

Из этого выражения следует, что h > 1 при К2 > Kl7 h = 1 при К2 = Кх и h < 1 при К2 < Кг. Эти соотношения выполняются при любых [X], хотя численные значения h при варьировании [X], конечно, меняются и при очень больших и очень малых [X] приближаются к единице. Кооперативное связывание (K2>Ki) невозможно без взаимодействия центров. Действительно, если молекула белка содержит связывающие центры, характеризующиеся различным сродством к ли-ганду,то первая молекула лиганда свяжется скорее всего с центром, обладающим более высоким сродством, и в результате функция насыщения будет обнаруживать отрицательную кооперативность. Поэтому экспериментально наблюдаемый кооперативный

Контроль ферментативной активности

175

характер функции насыщения является прямым указанием на существование взаимодействий между связывающими центрами. В то же время наличие отрицательной кооперативности для функции насыщения нельзя рассматривать как доказательство существования отрицательных взаимодействий между связывающими центрами1, если предварительно не доказана чистота белка, потому что отрицательная кооперативность может быть обусловлена наличием в молекуле белка неэквивалентных центров, взаимодействие между которыми отсутствует.

7.5. Подход Полинга

Подход Эдера позволяет описать экспериментально наблюдаемые свойства системы кислород—гемоглобин по крайней мере так же хороню, как и любая другая модель, предложенная позднее. Недостатком этого подхода является то, что он не рассматривает физической природы взаимодействий, ведущих к появлению кооперативности. В последние годы предложен ряд объяснений этого эффекта, однако прежде всего стоит кратко упомянуть об одном более раннем подходе, сформулированном в 1935 г. Полингом [124]. Не располагая информацией о геометрии молекулы гемоглобина, Полинг постулировал, что четыре гема (центры связывания кислорода) взаимодействуют друг с другом попарно таким образом, что связывание кислорода одним из центров пары приводит к увеличению константы ассоциации для связывания кислорода другим центром, причем степень увеличения константы ассоциации для обеих пар одинакова. Полинг показал, что если каждый гем взаимодействует только с одним гемом, т. е. если молекула содержит две независимые пары гемов, то соответствующее выражение для степени насыщения не может объяснить экспериментальные данные. Если же рассмотреть другую модель, в которой каждый гем взаимодействует с двумя другими (гемы располагаются в вершинах квадрата), то, подобрав соответствующим образом степень взаимодействия, удается вполне удовлетворительно объяснить получаемые зависимости. Аналогичный результат получен и для модели, в которой каждый гем взаимодействует с тремя другими (гемы располагаются в вершинах тетраэдра). Поскольку с математической точки зрения модель Полинга эквивалентна рассмотренной далее последовательной модели, анализ соответствующих функций насыщения отложен до разд. 7.8.

Принципиальное преимущество модели Полинга перед моделью Эдера состоит в том, что она включает только две констан-

" 1 Имеются в виду такого рода взаимодействия, когда сродство к лиганду уменьшается по мере заполнения связывающих центров. — Прим. перев.

176

Глава 7

ты, каждая из которых имеет ясный физический смысл: одна константа соответствует исходной константе ассоциации для каждого центра, а другая — «фактору возмущения», вызываемого связыванием кислорода на взаимодействующем связывающем центре. Если допустить, что гемы располагаются настолько близко, что между ними возможно электронное взаимодействие, то-объяснить попарное взаимодействие не составляет труда, поскольку подобные взаимодействия хорошо известны в простых системах. Именно поэтому Полинг не считал необходимым обсуждать детально физическую природу гем-гемовых взаимодействий. Рассмотрим, например, «связывание» электронов хиноном:

В принципе в этом случае должно образовываться промежуточное соединение, несущее свободный радикал, однако электронное состояние этого промежуточного соединения таково, что оно нестабильно и стремится перейти в одно из крайних состояний. В результате этого в соответствии с уравнением Хилла для двух центров связывание является кооперативным. Что касается отрицательной кооперативности, то она представляет собой даже более распространенное явление в простых системах (в качестве примера можно указать на связывание двух протонов симметричными дианионами, например оксалатом или сукцинатом).

Полинг пришел к заключению, что при тетраэдрическом расположении гемов на поверхности молекулы гемоглобина расстояния между ними слишком велики (около 4,7 нм), чтобы можно было допустить существование гем-гемовых взаимодействий. Однако если группы гема образуют квадрат на одной стороне апобелка, то они могут располагаться достаточно близко друг от друга. Поэтому Полинг отдал предпочтение схеме расположения групп гема в виде квадрата, хотя он понимал, что экспериментальные данные одинаково хорошо описываются обеими моделями.

После того как была установлена трехмерная структура гемоглобина [125], стало ясно, что группы гема располагаются слишком далеко друг от друга (2,5 — 4,0 нм), чтобы можнобыло допустить существование взаимодействий, постулированных По-лингом, даже если исходить из попарных взаимодействий гемов. Кроме того, в гемоглобине нет сопряженной системы химических связей, которая могла бы обеспечить взаимодействия на больших расстояниях (как, например, в витамине А и во многих других

Контроль ферментативной активности

177

окрашенных соединениях). Это открытие поставило под сомнение все объяснения кооперативного насыщения гемоглобина кислородом, выдвинутые не только Полингом, но и другими исследователями, включая объяснение Эдера, поскольку во всех этих случаях (в явной или неявной форме) предполагалось наличие прямых гем-гемовых взаимодействий. Явление кооперативности стало еще более загадочным, чем оно было после появления пионерской работы Хилла в 1910 г., и это произошло как раз в тот момент, когда выяснилось, что присуще оно не только гемоглобину, но и ферментам и поэтому играет исключительно важную роль в регуляции метаболизма.

7.6. Индуцированное соответствие

Все современные теории кооперативности вытекают иэ теории индуцированного соответствия, предложенной Кошландом [95—97], поскольку каждая из них включает допущение о том, что белковые молекулы не являются жесткими и могут существовать в нескольких функционально различающихся конформациях, число которых ограниченно. Поэтому целесообразно несколько отклониться от изложения основного материала и обсудить экспериментальные и теоретические основы гипотезы индуцированного соответствия.

Уже о самых первых работ, еще до того, как были получены какие-либо сведения о физической и химической структуре ферментов, биохимиков удивила высокая степень специфичности, обнаруживаемая ферментами по отношению к субстратам. Фишер [551 был поражен способностью живых организмов абсолютно точно распознавать нужное соединение среди Сахаров, лишь незначительно различающихся по структуре, причем эти изменения касались атомов, удаленных от реакционноспособных групп. Для того чтобы объяснить это свойство, Фишер предположил, что активный центр фермента представляет собой отпечаток, соответствующий его субстрату(ам), и что фермент катализирует превращение только тех соединений, которые в точности «вписываются» в его активный центр. Это очень похоже на открывание ключом обычного (нецилиндрического) замка, и предложенная модель действия ферментов давно известна как фишеровская модель ключа и замка. В течение многих лет казалось, что модель Фишера объясняет все известные факты, касающиеся специфичности ферментов. Однако в ходе дальнейших исследований накопились многочисленные данные, которые очень трудно было объяснить, исходя из представлений о жестком активном центре, как это постулировалось Фишером. К таким данным относится, например, факт большой распространенности ферментов, катализирующих двухсубстратные реакции, в которых субстраты долж-

7—282

178

Глава 7

ны связываться в строго определенном порядке (об этом упоминалось в разд. 5.2). Еще более удивительным является тот факт, что в определенных ферментативных реакциях вода вопреки ожиданиям участия не -принимает. Рассмотрим, например, гексоки-назу, катализирующую фосфорилирование глюкозы:

Глюкоза + АТФ--»- Глюкозо-6-фосфат + АДФ.

Фермент не отличается особой специфичностью: довольно быстрому каталитическому