фосфорилированию подвергаются не только глюкоза, но и фруктоза, манноза и другие сахара. Хотя с химической точки зрения вода обладает по крайней мере такой же реакционной способностью, что и сахара — субстраты гексокиназы, она не является одним из субстратов этого фермента; более того, вода едва ли способна насытить гексокиназу при концентрации 56 М (что в 7 ¦ 10е раз превышает константу Михаэлиса для глюкозы).

Кошланд высказал мнение, что эти и другие подобные им факты убедительно свидетельствуют о гибкости активного центра фермента. Кошланд предположил, что активный центр обладает способностью точно подстроиться под субстрат, однако он не принимает формы, комплементарной по отношению к субстрату, пока не произойдет связывания последнего. Благодаря этому конфор-мационному изменению, сопровождающему связывание субстрата, достигается правильное расположение каталитических групп фермента и групп субстрата, претерпевающих изменения в ходе каталитической реакции. Гипотеза Кошланда позволяет легко объяснить свойства гексокиназы: молекула воды может, конечно, присоединяться к активному центру фермента, однако из-за недостаточных размеров она не способна вызывать необходимое для катализа конформационное изменение.

Идея Кошланда была названа гипотезой индуцированного соответствия, чтобы подчеркнуть ее отличие от теории Фишера, в которой допускается, что соответствие между ферментом и субстратом существует заранее и необходимость в индуцированном конформационном изменении отпадает. Если исходить из аналогии между ключом и замком, то концепцию Кошланда можно уподобить цилиндрическому замку, в котором ключ не просто подходит, но перед поворотом перестраивает подвижные части замка.

Теория индуцированного соответствия сыграла важную роль в некоторых областях энзимологии, однако особенно полезной оказалась она для понимания аллостерических и кооперативных явлений в белках, поскольку эта теория дает простое объяснение взаимодействий, осуществляющихся на больших расстояниях. Когда белковая молекула соединяет в себе жесткость и подвижность и таким образом обеспечивает выполнение определен-

Контроль ферментативной активности

179

ной функции и возможность контроля (как это имеет место в ножницах), индуцируемое субстратом конформационное изменение в одной точке молекулы может передаваться в другую точку на расстояния, достигающие нескольких нанометров.

7.7. Симметричная модель Моно, Уаймена и Шанжё

Для объяснения кооперативных явлений в гемоглобине и аллостерических эффектов для многих ферментов. необходимо допустить существование взаимодействий между центрами, значительно удаленными друг от'друга. Ярким примером фермента с пространственно обособленными активным и аллостерическим центрами может служить фосфорибозил-АТФ-пирофосфорилаза, по отношению к которой гистидин выступает в роли аллостери-ческого ингибитора; Мартин [109] показал, что мягкая обработка фермента ионами . двухвалентной ртути приводит к полной потере чувствительности фермента к гистидину, однако при этом активность фермента и способность связывать гистидин остаются неизменными. Другими словами, ион металла, не затрагивая каталитического и аллостерического центров, нарушает связь между ними. Моно, Шанжё и Жакоб [115] рассмотрели много примеров кооперативных и аллостерических явлений и пришли к заключению, что они тесно связаны между собой и что в основе их лежит, по-видимому, конформационная гибкость белковой молекулы. Позднее Моно, Уаймен и Шанжё [116], сделав ряд простых допущений, предложили общую модель для объяснения кооперативных и аллостерических явлений. Эту модель часто называют аллостперической моделью, хотя более удачным является термин симметричная модель, поскольку он подчеркивает принципиальное различие между этой и более поздними моделями; кроме того, использование этого, термина позволяет не касаться спорного вопроса о связи между аллостерическими и кооперативными явлениями.

Исходным пунктом для симметричной модели является тот -факт, что многие (по-видимому, даже все) белки, обнаруживающие кооперативные эффекты, содержат несколько субъединиц на молекулу. (Для простоты мы будем рассматривать тетрамерный белок, однако модель пригодна для любого числа субъединиц на молекулу.) Модель Моно и др. основывается на следующих постулатах:

1. Каждая субъединица может существовать в двух различных конформациях, обозначаемых через R («расслабленная») и Т («напряженная»).

2. В любой момент времени все субъединицы молекулы имеют одну и ту жеконформацию; следовательно, в случае тетрамерного белка единственно допустимыми конформационными состояниями 7*

180

Глава 7

являются состояния R4 и Т4, а гибридные состояния (например,. R3T) запрещены.

3. Формы белка, соответствующие разным состояниям, находятся в равновесии; константа равновесия, обозначенная через l, равна [T4I/[RJ.

4. Лиганд может связываться с субъединицей, находящейся в любой конформации, однако константы диссоциации для R-cocto-яния {KR = [RKXMRX]) и для Т-состояния {Кт = [Т][Х]/[ТХ]) различаются между собой; отношение констант обозначается через с (с = KR IKf ).

На основе этих допущений переходы между различными формами белка можно представить в виде следующей совокупности равновесных стадий:

4IX]/>iT

|[х]/л-т

§М//СТ

ГнХ3 ч-

:Т4Х3 1

R4X4

Т4Х4

Концентрации десяти форм связаны между собой следующими соотношениями:

[R4X]

[R4XJ = [RtXs] =

[R4XJ:

[TJ = [T*X] =

4[RJ[X]//CR,

_3

2 _2

3

-f [R4X][X]/tfR = 6[R4][X]WR, [R4XJ[X]//TR =4[R4][Xf/KR,

= -L[R4 XJ[X]/tfR- = [R4J[X]4/^4R, 4[TJ[X]//fT = 4Lc[R4][X]//CR,

Контроль ферментативной активности

181

- [Т4 Х2] = 6 [Т4] [Xf/Kl = 6Lc2 [R4] [Xf/K%,

[T4 X3] = 4 [TJ [X] WT = 4Lc3 [R4] [Xy/K%,

[T4 XJ = [TJ [Xf/Ki = Lc* [R J [Х]*/Я< .

Статистические множители (4, 3/2 и т. д.) появились в каждом уравнении в результате того, что Кц и Кт определены как микроскопические константы, характеризующие связывание лиганда индивидуальным центром белковой молекулы, в то время как приведенные соотношения записаны для полных молекул, а не для от-

дельных центров. Например, KR = [R][X]/[RX] = y[R4X][X]/

/[R4X2]; множитель -g- означает, что в каждой молекуле R4X имеется 3 R-субъединицы, не содержащие лиганда, а в каждой молекуле R4X2 — 2 R-субъединицы, содержащие связанный лиганд. Зависимость степени насыщения от концентрации свободного лиганда для тетрамерного белка модели Моно и др. имеет следующий вид:

[R4X] + 2 [R4 Х2] + 3 [R4 Х3] + 4 [R4X4] + у =_+ [T4X] + 2 [T4 Х2] + 3 [Та Х3] + [Т4 Х4]_ =

4 ([R41 + [R4X] + [R4 Х2] + [R4 Х3] + [R4 Х4] +

+ [Т4] + [Т4Х] + [Т4 Х2] + [Т4 Х3] + [Т4 Х4])

(1 + [X]/gRy [X)/KR + ?с(1 + с [X]/gR)3 [Х)/Кн

(i + [X]/KR)4+L(i + c [Х]/кп у

(7.10)

Функция насыщения, задаваемая уравнением (7.10), зависит от значения величин Luc. Рассмотрим прежде всего некоторые случаи, соответствующие крайним значениям этих параметров. При L = 0 (форма Т не обнаруживается ни при каких условиях) уравнение (7.10) приобретает простой вид: Y = [X]I(Kr -+- [X]); это уравнение идентично' изотерме Лэнгмюра. Аналогичным образом при L->- со имеем Y = [Х]/(.йГт -f- [X]). Отсюда следует, что отклонение от гиперболического связывания наблюдается только в том случае, когда формы белка, соответствующие обоим конформационным состояниям, присутствуют в заметных количествах. Это естественно, поскольку, если присутствует только одна форма, модель Моно и др. становится эквивалентной модели Эдера с невзаимодействующими и идентичными связывающими центрами [сравните с уравнением (7.8)1.

Гиперболическое связывание наблюдается также в том случае, когда формы R и Т обладают одинаковым сродством к лиганду (с = 1), так как в этом случае неважно, в каком состоянии находится белок. При других значениях L и с, согласно уравнению (7.10), будет иметь место кооперативное связывание, хотя оче-

182

Глава 7

видным это становится только в частном случае, когда с = О (X связывается только формой R). Подобная ситуация естественна для теории индуцированного соответствия, однако Моно, Уаймен и Шанжё но считают ее обязательной и для симметричной модели. При с = 0 уравнение (7.10) сводится к виду ¦

При очень больших [X], когда [X]/Kr S> L и величиной L в знаменателе можно пренебречь, выражение становится аналогичным изотерме Лэнгмюра. При очень малых [X] величина L, напротив, становится определяющей, вследствие чего кривая насыщения выходит из начала координат очень полого. Другими словами, зависимость степени насыщения от концентрации лиганда должна быть сигмоидной, если L У?> 1.

Для того чтобы показать, почему из уравнения более общего типа (7.10) следует наличие кооперативного связывания, выявим его связь с уравнением Эдера. Если раскрыть все скобки в уравнении (7.10) и сгруппировать члены, содержащие [X] в одинаковой степени, то уравнение примет вид уравнения Эдера для белка с четырьмя центрами (7.7). Константы ассоциации в этом уравнении определяются следующим образом:

l+Lc

1 + Z,c2

*4 =

(1+?е)Я„

(l+Lc*)KR 1 + Lc*

Рассмотрим теперь отношение какой-либо пары констант, например К3 и Kz:

К3 _ (1 + Lc3) (1 + Lc) 1 + Lc (с2 + 1) + L2 с* К2 ~~ (1+Le2)2 ~~ 1 -f- 2LC2 -f- L2 с*

Поскольку при положительных Luc выполняется неравенство Lc (с2 -+- 1) 2Lc2, правая часть выражения для К3/К2 не может быть меньше 1, т. е. К3 :> К2. Аналогичные результаты получаются для всех других пар констант, а также при обобщении модели на случай более четырех связывающих центров на молекулу и более двух конформационных состояний. Поэтому симметричная модель должна давать положительную кооперативность

Контроль ферментативной активности

183

и не может привести к появлению отрицательной кооперативности. Некоторые характерные кривые связывания для модели Моно и др. показаны на рис. 7.3.

Моно, Уаймен и Шанжё проводили различие между гомотроп-ными эффектами, обусловленными взаимодействием между идентичными лигандами, и гетеротропными эффектами, возникающими из-за взаимодействий между лигандами разл