ичной природы,

О 12 3 4 5 6

1дШ

Рис. 7.3. Зависимости степени насыщения от логарифма концентрации лиганда для симметричной модели, рассчитанные при помощи уравнения (7.10) для с = 0,01 и значений L в интервале от 0 до со (значения L приведены около

кривых).

[X] выражена в произвольных единицах. Кривая, соответствующая L = 0, отражает связывание лиганда чистой формой R, а кривая с L = оо — связывание лиганда чистой формой Т. Если уравнение (7 10) представить в координатах Y от [X]. а не от 1 [X], то кривые при этих крайних значениях L будут гиперболами (рис. 7.1), а при промежуточных L — сигмоидными.

например между субстратом и аллостерическим ингибитором. Хотя в модели'Моно и др. гомотропные эффекты должны характеризоваться положительной кооперативностью, на гетеротропные взаимодействия подобные ограничения не распространяются. Одной из самых привлекательных особенностей симметричной модели является то обстоятельство, что при переходе к гетеротропным эффектами этой модели не происходит дополнительного усложнения математических выражений. Рассмотрим случай, когда в системе присутствуют три лиганда: X, А и I. Допустим, что X и А свя-

184

Глава 7

зываются только R-конформацией (К# и Ка — соответствующие константы диссоциации), а I — только Т-конформацией (константа диссоциации обозначается через К t). (Заметим, что связывание при таком упрощении описывается уравнением (7.11); можно рассмотреть, конечно, и более общий случай, однако при этом предсказания модели станут менее наглядными.) Тем же путем, что и ранее, для данной системы можно рассчитать функции насыщения для трех лигандов. Так, для связывания лиганда X функция насыщения имеет следующий вид:

Если ввести обозначение А = L(l + Ш/Яг)4/(1 + [А]Щ4, то это выражение перейдет в

Полученное уравнение аналогично уравнению (7.11), только константа L заменена в нем на величину А, которая является функцией как [I], так и [А]. Ясно, что I подавляет связывание X (потому, что А растет с увеличением Ш), а А, напротив, способствует связыванию. Таким образом, модель Моно и др. дает четкое объяснение как явлению аллостерического ингибирования, так и явлению аллостерической активации. Кроме того, поскольку А зависит от концентрации I и А, последние должны оказывать влияние и на степень кооперативности, причем, согласно модели Моно и др., аллостерический ингибитор должен усиливать кооперативность связывания субстрата, а аллостерический активатор, напротив, снижать ее.

Как отмечали Моно, Уаймен и Шанжё, многие ферменты действительно обладают подобными кинетическими свойствами, если принять, конечно, что связывание субстрата в стационарных условиях точно отражает связывание в условиях равновесия. К со^ жалению, единственное оправдание для^введения любого допущения подобного типа не только для простых систем, но и для сложных, состоит в том, что если таких допущений не делать, то мы должны проводить опыты по связыванию лигандов в истинно равновесных условиях (типа опытов по связыванию кислорода и других лигандов гемоглобином). Большинство биохимиков находят это ограничение неприемлемым, и на практике основная часть данных о гетеротропных эффектах (и, конечно, о гомотропных эффектах в случае кооперативных ферментов) получена из неравновесных исследований ферментов при допущении, что Y = v/V,

(l + [X]/gR)3[Xl/gR

(l + [X]/gR)»[X]/gR A-r-(l + [X]/XR)4

Контроль ферментативной активности

185

где v — стационарная скорость и У — предельное значение v при насыщающих концентрациях субстрата.

Доказать выполнимость допущения, что Y = vIV, очень трудно ( или даже невозможно). Однако обычно обойтись без него не удается, так как пытаться интерпретировать кинетические данные для кооперативных ферментов, не вводя никаких упрощающих предположений, — задача совершенно безнадежная. Это не является, конечно, свойством только симметричной модели — все другие модели кооперативности также построены при некоторых допущениях. Предположение о том, что Y = v/V, имеет по крайней мере то достоинство, что оно кажется весьма правдоподобным, чего нельзя сказать о ряде других допущений, используемых в симметричной модели. Таким является, в частности, основное допущение о симметрии конформацин белковой молекулы, чья спорность не уменьшается от того, что его часто используют. Симметричная модель не рассматривает молекулярного механизма, объясняющего конформационную симметрию, и с физической точки зрения неясно, почему белки, имеющие субъединичную структуру, должны обладать подобным свойством. Другое не очень обоснованное допущение состоит в том, что многие ферменты рассматриваются как истинные К-систезш (в терминологии Моно, Уаймена и Шанжё). Иными словами, допускается, что хотя R- и Т-состояния могут различаться в 1000 и более раз по степени сродства к субстрату, константы каталитического распада у них совершенно одинаковы. Вопрос о том, насколько вероятно существование истинных К-систем, никогда серьезно не обсуждался в литературе. Действительно, допущение о равенстве констант скорости каталитического распада для R- и Т-форм часто рассматривается как аксиома, не требующая доказательства.

Несмотря на эти критические замечания, следует отметить, что симметричная модель означала большой шаг вперед в понимании кооперативности белковых молекул. Хотя в настоящее время имеются данные по отрицательной кооперативности, которые не удается объяснить с позиций симметричной модели, кинетические свойства ряда ферментов эта модель описывает вполне удовлетворительно. Например, Бланжи, Бюк и Моно [11] использовали симметричную модель для количественного описания кооперативных свойств фосфофруктокиназы из Escherichia coli. Этот фермент представлял особый интерес в связи с возможностью проводить измерения связывания одного субстрата, фруктозо-6-фосфата, в широком интервале концентраций аллостерического активатора, АДФ, и аллостерического ингибитора, фосфоенолпирувата. Точное согласие между теорией и экспериментом для всех полученных данных можно рассматривать как веский довод в пользу адекватности симметричной модели.

186

Глава 7

7.8. Последовательная модель Кошланда, Немети и Филмера

Хотя в симметричной модели используется идея функциональной важности конформационной подвижности белковой молекулы, она все же является отступлением от теории индуцированного соответствия, поскольку допускает, что лиганды могут связываться с обоими конформационными состояниями (R и Т), хотя и имеют к ним разное сродство. В то же время Кошланд, Немети и Филмер [98] показали, что обычный подход, основанный на использовании теории индуцированного соответствия, также хорошо объясняет явление кооперативности. Подобно Моно, Уай-мену и Шанжё, эти исследователи постулировали существование двух конформации, обозначенных ими как А- и В-конформации (соответствующие Т-и R-конформациям). Однако Кошланд, Немети и Филмер предположили, что конформация В индуцируется связыванием субстрата, поэтому X оказывается связанным только В-конформацией, а В-конформация в свою очередь существует только в том случае, если она содержит связанный X.

Кошланд, Немети и Филмер предположили, что кооперативность обусловлена изменением свойств каждой субъединицы при изменении конформационного состояния соседних субъединиц. Это допущение используется и в симметричной модели, но в последовательной модели оно более существенно, поскольку в ней делается акцент на детали взаимодействия и не привлекается произвольное допущение о том, что все субъединицы должны находиться одновременно в одной и той же конформации. Следовательно, существование таких конформационных гибридов, как АВ3, А2В2 и т.д., не просто допускается; это с необходимостью вытекает из предположения о строгом индуцированном соответствии.

Поскольку симметричная модель не касается деталей взаимодействия субъединиц, в предыдущем разделе не было необходимости обсуждать геометрию ассоциации субъединиц, т.е. четвертичную структуру белков. Однако в последовательной модели учитывать геометрические факторы необходимо, потому что различное расположение субъединиц приводит к различным зависимостям степени насыщения от концентрации лиганда. То обстоятельство, что в последовательной модели уделяется большое внимание геометрическим факторам и что каждый тип «геометрии взаимодействия» субъединиц должен рассматриваться отдельно, привело к широко распространенному, но ошибочному заключению, что эта модель является более общей и более сложной, чем симметричная. Следует подчеркнуть, что для любой заданной геометрии взаимодействия субъединиц обе модели приблизительно одинаково сложны, причем ни одна из них не яв-

Контроль ферментативной активности

187

ляетсн частным случаем другой. Симметричную и последовательную модели можно свести к одной общей модели [63], если снять требование симметрии в первом случае и требование строго индуцированного соответствия во втором. Однако целесообразность такого обобщения весьма сомнительна, поскольку получаемое при этом окончательное уравнение слишком сложно, чтобы им можно было пользоваться на практике. В отдельных случаях имеет смысл называть обычный вариант последовательной модели как простейшую последовательную модель, чтобы отличать ее от общей модели.

Рассматривая последовательную модель, обсудим более детально так называемый квадратный тип взаимодействия субъединиц, когда каждая субъединица взаимодействует с двумя соседними (расположение субъединиц напоминает квадрат). Для четырех субъединиц в молекуле возможны также «тетраэдри-ческий» и «линейный» типы взаимодействия субъедйниц, однако методы анализа в этих случаях такие же, как и для квадратной модели (хотя окончательные результаты несколько различаются). Если обозначить А-конформацию кружочком, а В-конформацию— квадратиком, то шесть возможных форм для связывания X можно изобразить следующим образом:

А4 А3ВХ А2В2Х2 АВдХ3

Следует отметить, что существуют две различные формы А2ВаХ2; каждую из них нужно рассматривать отдельно, потому что контакты субъединиц в них неодинаковы. Для получения выраж