ений, описывающих концентрации различных форм, необходимо учесть те изменения конформацин, которые должны произойти, чтобы получить эту форму из исходного состояния А4. Например, для превращения формы А4 в форму АВ3Х3 необходимы следующие изменения:

1. Для трех субъединиц должно произойти изменение кон-формации А—»- В. Это изменение учитывается величиной Kt3, где Kt — воображаемая константа равновесия для изолированной субъединицы (Kt = [В]/[А]). В простейшей последовательной модели молчаливо принимается, что константа Kt очень мала; лишь в этом случае справедливо допущение о том, что переход в В-конформацию обусловлен только связыванием субстрата.

2. Три молекулы X должны присоединиться к трем субъединицам В. Это связывание учитывается величиной КзЛХ]3, где

188 \ Глава 7

К — константа ассоциации для процесса связывания лиганда X изолированной субъединицей В (Кх = [ВХ]/[В][Х]). /

3. Для квадратного типа взаимодействия субъединип/ число контактов равно 4. В исходном состоянии (А4) каждый контакт можно обозначить как АА, поскольку обе контактирующие субъединицы находятся в А-конформации. В форме АВ3Х3 контакты АА отсутствуют, зато в ней имеются два АВ-контакта и два ВВ-кон-такта. Им соответствуют параметр Кав— константа равновесия для превращения АА-контакта в АВ-контакт (/Cab = [АВШАА]) — и параметр Квв — константа равновесия для превращения АА-контакта в ВВ контакт (Квв = [ВВ]/[АА]). Суммарное изменение учитывается параметром К-ав^шг Константа Кав может рассматриваться также как абсолютная мера стабильности АВ-контакта, однако в таком случае необходимо ввести еще один параметр — константу Каа для АА-контакта, которая условно принимается равной единице. Проще и корректнее всего рассматривать Кав как относительную меру стабильности АВ-контакта по сравнению с АА-контактом; в таком случае нет необходимости вводить дополнительную константу Каа- Аналогичным образом константу Квв лучше рассматривать как относительную меру стабильности ВВ-контакта по сравнению с АА-контактом.

4. Наконец, необходимо ввести статистический множитель, равный 4, поскольку три субъединицы из четырех можно выбрать четырьмя эквивалентными способами. Эквивалентность способов необходима, поскольку в противном случае все варианты должны рассматриваться отдельно: для формы А2В2Х2 при диагональном расположении лигандов статистический множитель равен 2, а при расположении, когда В-субъединицы соприкасаются,— 4.

Перемножая все параметры, которые должны быть учтены, получаем следующее выражение для концентрации формы АВ3Х3:

[АВ3 Х3] = 4[А4]К* К] KL Квв [X]».

Аналогичным образом для концентраций других форм можно записать

[А3ВХ] = 4[А4]^К(КАВ[Х], [A2B2XJ = 2[AJK* К] (2гСАВ Квв + КАВ )[ХР, [В4Х4] = [А4]<<^В[Х]*.

Исходя из этих соотношений, приходим к уравнению, описывающему зависимость степени насыщения от концентрации ли- ¦ ганда:

Контроль ферментативной активности

189

[А3ВХ] + 2 [А2В2Х2] + 3 [АВ3Х3] + 4 [В4Х4] 4 [А4] + [А3ВХ] + [А2В2Х2] + [АВ3Х3] + [В4Х4] ~

\{КХ Kt КАЪ [X] + К2, К] (2К\В квв + К*АВ) [ХР +

_+ М* К] К\в К%в [X]» + Кх К* Квв [Х]«}

[\+4КхК, К\в [X] + 2К\К* (2К2АВ Квв + КАВ) [Хр +

+ «2 *? «ав 4в [XI3 + К К* Квв [X]*}

(7.12)

В таком виде уравнение выглядит довольно сложно, так как отражает все детали связывания лиганда. На самом деле эта сложность кажущаяся, поскольку некоторые константы встречаются всегда в одних и тех же комбинациях. Например, Кх, Kt и [X] входят только в виде произведения, согласно идее строго индуцированного соответствия. Имеются и другие, менее очевидные комбинации, обусловленные тем, что взаимодействия'субъединиц же являются независимыми от связывания лиганда. Например, ионстанта Квв встречается только как член произведения, которое содержит Kx2Kt4X]2, потому что ВВ-взаимодействие подразумевает присутствие двух субъединиц. В результате уравнение '(7.12) можно переписать, используя две константы:

у = с* К [XI + с* (2 + с*) К* [ХР + Зс* К» [Х]з + К* [ХР ^ ig

1 + 4с2 К [X] + 2с2. (2 + с«) К* [Хр + 4с2 К? [Х]3+ К* [X]*

где К* = Кх Kt Квв = [В4Х4]/[А4][Х]4 — константа ассоциации для полного четырехступенчатого связывания и с2 = Кав?/Квв — относительная мера стабильности ДВ-контакта по сравнению с АА- и ВВ-контактами. Ценность уравнения (7.13) состоит в том, что именно в такой форме должно быть представлено уравнение для зависимости степени насыщения от концентрации лиганда при количественном описании экспериментальных данных. Уравнение связывания в исходном виде для этого не годится, потому что, например, любое изменение Кх может быть абсолютно точно компенсировано противоположным изменением констант Kt или Квв- Некоторые кривые, рассчитанные при помощи уравнения (7.13), представлены на рис. 7.4.

Уравнение (7.13) оказывается полезным также при выяснении связи между последовательной моделью и моделью Эдера. Четыре константы уравнения Эдера связаны следующими соотношениями о константами К из уравнения (7.13):

Ki = c*K,

Я2=-|-(2 + с2)К,

190 Глава 7

lg[X]

Рис. 7.4. Зависимости степени насыщения от логарифма концентрации лиганда для последовательной модели, рассчитанные при помощи уравнения (7.13): для различных значений Кис (эти значения приведены около кривых). [X] выражена в произвольных единицах. Положение точки полунасыщения для каждой" кривой определяется только величиной К, а (Jc-рыа— только величиной г.

Поэтому Ка<Къ, если с > 1, и К3 > К2, если с <; 1. Аналогичные соотношения справедливы и для других пар констант. Поскольку в последовательной модели никаких ограничений на параметр с не накладывается (он может быть меньше или больше единицы), эта модель объясняет как отрицательную кооперативность (Ki > К2 > К3 > KJ, так и положительную (Кг < К2 < К3 < К*),

-в то время как в симметричной модели возможна только положительная кооперативность.

Кошланд, Немети и Филмер показали, что уравнение (7.13)

. и соответствующее уравнение для тетраэдрического типа взаи-

Контроль ферментативной активности

модействия субъединиц почти так же хорошо описывают экспериментальные данные по насыщению гемоглобина кислородом, как и симметричная модель. Поэтому на основании этих данных для гемоглобина и любых данных по кооперативному связыванию "лигандов другими белками трудно сделать выбор между моделями. Однако Wo не означает, что кривые насыщения никогда Не позволяют дифференцировать модели: для белка, обнаруживающего отрицательную кооперативность, сама форма кривой насыщения дает достаточные основания для того, чтобы исключить симметричную модель. В последние годы появились сообщения об отрицательной кооперативности для насыщения белков лигандами. В'некоторых случаях подобный характер кривой насыщения обусловлен присутствием в препарате белка примесей. В то же время •связывание НАД глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой из скелетных мышц кролика обнаруживает настолько сильно выраженную отрицательную кооперативность [33], что такое объяснение вряд ли подходит.

Хотя первоначально последовательная модель была построена для объяснения гомотропных взаимодействий, позднее Киртли и Кошланд [90] обобщили ее на случай присутствия в системе аллостерического ингибитора и аллостерического активатора Для объяснения гетеротропных взаимодействий. Подход Киртли и Кош-ланда трудно представить здесь в сжатой форме, поскольку эти авторы обсудили несколько возможных вариантов модели, каждый из которых с той или иной вероятностью может реализоваться для разных белков. Однако подход Киртли и Кошланда достаточно прост, и его нетрудно применить при любых исходных дог лущениях. Хотя Киртли и Кошланд понимали, что второй лиганд может индуцировать появление новых конформаций, отличных от А и В, они пришли к выводу, что, поскольку при этом модель становится чрезвычайно сложной, во всех случаях, когда нет прямых оснований отвергать модель с двумя конформациями, к более сложным моделям прибегать не следует. Поэтому авторы ограничились рассмотрением тех же самых двух конформаций (А и В) и допустили, что лиганд, представляющий основной интерес (X), может связываться только с субъединицей в В-конфор-» мации. Далее мы ограничимся рассмотрением только одного из возможных способов связывания второго лиганда L (существуют, конечно, и другие способы связывания, однако их анализ проводится аналогичным образом). Допустим, что белок представляет собой димер и что лиганд L может связываться только субъединицей в В-конформации, причем L конкурирует с X за связывание с одним и тем же центром. Иначе говоря, X и L не могут быть связаны одновременно одной и той же субъединицей. При этих допущениях образуются следующие комплексы:

192

Глава 7

ОО

А2

сш

АВХ

fxlxl

В2Х2

ED

ABL

B,LX

ш

Если мы определим параметры Кх, К и Кав и Къв так же, как и ранее, а через Kl обозначим константу ассоциации для связывания L субъединицей в В-конформации (Kl = [BL]/[B] [L ]), то аналогично тому, как это было сделано выше, можно рассчитать концентрации всех форм. Например, концентрация формы BaLX задается следующим выражением:

[B2LX] = 2[A2]KXKL[K2 Квв [X][L].

Объединяя все такие, соотношения, получаем уравнение для степени насыщения белка лигандом L:

[ABX]+2[B2X2] + [B2LX]

2 ([Aa] + [АВХ] + [В2Х2] -f [ABL] + [B2LX] + [B2L2]) KxKt KAB [X] +&xE;?t Квв РФ + KxKL K\Km [X] [L] (1 + 2KX Kt KAB [X] +K2X K\ Kbb [X]2 + 2KL Kt KAB [L] +

+2kx KL K\ Квв [X] [L] + K\ K2t KBB [Lp )

При любом фиксированном значении [L] это уравнение совпадает по форме с уравнением Эдера для связывания X, только константы ассоциации в Нем зависят от [L1:

Кх Kt (КЛЪ + KL Kt КВВ ILD 1 + 2KL Kt KAB [L] + Kl K\ KBB [LP

KxKtKBB

KAn + KbKtKBB{b\

Контроль ферментативной активности

193=

Отношение К^К\ равно

\ к2 = 1 + 2KL Kt КАъ [L] + Kj к\ ЛГВВ [L]* \ *i с* + 2KL Kt КАВ [L] + Я| Л?*вв [LP

Здесь с2, как и ранее, представляет собой отношение Кав/Квв. Из этих уравнений видно, что хотя лиганд L напоминает обычный конкурентный ингибитор, его влияние на связывание X осложняется взаимодействием субъединиц.Что касается второго с