Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

вязывающего центра в белковой молекуле, то L действует исключительно-как ингибитор, так как /С2 монотонно падает с ростом [L]. Однако если Двв> 2К.ав (т. е. с2 < 1/2), то L при низких концентрациях действует как активатор, потому что в этом случае числитель выражения для Ki растет вначале с ростом [L] более круто, чем знаменатель. Влияние L на кооперативность связывания X совершенно ясно; это видно из уравнения (7.14): независимо» от того, что имеет место в отсутствие L— положительная или отрицательная кооперативность, повышение концентрации L сопровождается уменьшением кооперативности до полного ее исчезновения.

Поскольку имеется большое число других не менее приемлемых вариантов связывания лиганда L. (например, этот лиганд может связываться только субъединицей в А-конформации, или одновременно с X, или индуцировать третью конформацию, или связываться после того, как связался X), ясно, что анализ общего случая связывания двух лигандов в рамках последовательной модели намного более сложен, чем в рамках симметричной модели. Однако возникает вопрос, можно ли считать симметричную модель более простой, если ее алгебраическая простота достигается ценою упрощения основной концепции: допущение о конформаци-онной симметрии хотя и элегантно, по существу произвольно. Кроме того, последовательную модель можно применить для описания кинетических данных без введения другого произвольного допущения, используемого в симметричной модели, состоящего в-том, что ферменты представляют собой истинные /(-системы. В последовательной модели предполагается, что субстрат связывается только субъединицей в В-конформации. Следовательно, для всех каталитических стадий локальное окружение субстрата одинаково и, естественно, все они характеризуются одной и той же константой скорости.

Наконец, рассмотрим вкратце согласованную модель. Следуег отметить, что на самом деле она не представляет собой еще одну, новую модель аллостерических взаимодействий; это название Кошланд, Немети и Филмер предложили для частного случая симметричной модели, описываемого уравнением (7.11). Для того чтобы облегчить сопоставление согласованной модели с последо-

194

Глава 7

ватепьной, эти авторы ввели свои обозначения, однако/ следует подчеркнуть, что согласованная модель не является частым случаем последовательной модели, и было бы ошибочным ^полагать, что это так. /

7.9. Реакционная способность половины связывающих центров /

После открытия явления отрицательной кооперативности появилось очень много работ, посвященных этому вопросу (см. 1104]). Некоторые примеры такого рода классифицированы как реакционная способность половины связывающих центров (half-of-the-sites reactivity) [105] — крайний случай отрицательной кооперативности, когда реакционную способность по отношению к субстрату или к другим реагентам обнаруживает только половина всех совершенно одинаковых субъединиц белковой молекулы. Этот тип отрицательной кооперативности согласуется с последовательной моделью, в особенности если учесть тот факт, что индивидуальные субъединицы любого белка асимметричны, и поэтому маловероятно, чтобы все контакты между субъединицами были одинаковыми [38]. Однако Мак-Кварри и Бернхард [107] предложили другое объяснение реакционной способности половины связывающих центров, которое исходит из предсуществу-ющей асимметрии. Эти авторы считают, что в некоторых белках идентичные субъединицы располагаются таким образом, что в зависимости от окружения их можно разбить на две группы, т.е. белковая молекула асимметрична даже в отсутствие лиганда. Это не противоречит подходу, использованному в последовательной модели. Корниш-Боуден и Кошланд [39], исходя из проведенного ими при помощи ЭВМ анализа ассоциации субъединиц, пришли к заключению, что a priori нельзя "считать, что идентичные субъединицы занимают в олигомере равноценные позиции. Однако сторонники последовательной модели (см., например, [136]) для простоты обычно допускают симметричное расположение субъ-едиНиц, если против этого нет веских возражений. Свидетельства в пользу предсуществующей асимметрии детально рассмотрены в работе [133]; здесь мы этот вопрос затрагивать не будем.

7.10. Другие равновесные модели кооперативности

Фриден [56], с одной стороны, и Николь, Джексон и Винзор [120] — с другой, высказали независимо друг от друга мнение, что в некоторых случаях кооперативность может быть связана с существованием равновесия между формами белка, различаю-

Контроль ферментативной активности 195-

щимисяшо степени агрегации, например равновесия между мо-номером\А и тетрамером В4'

\ -о = —

\ — 4

4А В4

Если допустить, что эти формы обладают разным сродством к лиганду, то подобная модель по сути будет близка к симметричной и, как и последняя, будет предсказывать кооперативное связывание лиганда. Однако уравнения, описывающие связывание^ лиганда, имеют в этом случае гораздо более сложный вид: в них входит концентрация белка, так как от нее зависят относительные-количества свободных форм А и В4.

Основное преимущество модели диссоциирующего белка состоит в том, что ее гораздо легче проверить экспериментально,, чем модели, рассмотренные ранее: связывание лиганда в этом случае должно сопровождаться большим изменением молекулярного-веса белка и степень кооперативности должна зависеть от концентрации последнего. Эти особенности связывания лиганда характерны только для модели диссоциирующего белка, и их легко выявить экспериментально. Фриден и Колмэн [57] показали, например, что обратимая ассоциация позволяет полностью объяснить связывание различных нуклеотидов глутаматдегидрогеназой. Процессы диссоциации—ассоциации белковой молекулы могут давать определенный вклад в кооперативность и в случае гемоглобина, который способен диссоциировать на димеры в растворах с высокой концентрацией соли. Однако одной только диссоциацией объяснить.кооперативное связывание кислорода не удается, поскольку оно наблюдается во многих случаях, когда диссоциация отсутствует. При работе с любым белком необходимо всегда проверять, зависит ли наблюдаемая кооперативность от концентрации белка. В тех случаях, когда обнаруживается изменение степени кооперативности белка, в качестве возможной причины следует рассматривать диссоциацию.

1 Одновременно подобная идея была высказана Б. И. Кургановым (см. Б. И. Курганов, Химия и технология полимеров, 11, 140, 1967). В этой же-работе был впервые указан принципиальный путь доказательства механизма кооперативности, в основе которого лежит смещение равновесия между оли-гомерными формами под действием лиганда. (Более подробно см. Б. И. Курганов, Аллостерические ферменты, М., «Наука», 1978.) — Прим. перев.

196 Глава 7

7.11. Кинетические модели кооперативности

Все рассмотренные выше модели являются по существу равновесными, и они пригодны для интерпретации кинетических данных только в том случае, если величину vIV можно считать1 истинной мерой Y. Для объяснения кооперативности построено также несколько чисто кинетических моделей, не имеющих аналогов ¦среди равновесных моделей. Простейшей среди них является модель, предложенная Рабином [126]:

E+S^ES U

S*E'S-Er+P

Е'+

Если равновесие между Е и Е' сдвинуто в сторону образования Е, в равновесие между ES и E'S — в сторону образования E'S (для того чтобы отметить это, мы воспользовались тонкими и жирными стрелками), то S должен связываться более прочно формой Е', чем формой Ё, поскольку для соблюдения второго закона термодинамики необходимо, чтобы константа равновесия для полной реакции Е + S E'S была одинаковой независимо от пути, по которому совершается переход от Е к E'S. Если реакция распада E'S —*- Е' + Р протекает гораздо быстрее, чем реакции изомеризации Е'->- Е hES ->-E'S, то процесс связывания субстрата не может достичь равновесия. При низких концентрациях S форма Е' изомеризуется в Е еще до того, как S успеет с ней связаться. При высоких же концентрациях S последний имеет возможность связаться с Е', прежде чем эта форма превратится в Е. Таким образом, кажущееся сродство фермента к субстрату растет при увеличении концентрации субстрата, или, иными словами, связывание субстрата является кооперативным. Важно подчеркнуть, что реакция E'S->-Е' + Р должна быть быстрой: если эта стадия настолько медленна, что лимитирует скорость ферментативного процесса, нарушения равновесия в связывании субстрата не происходит и насыщение субстратом не может быть кооперативным.

Как видно из разд. 5.2, в том случае, когда субстраты связываются неупорядоченно, Полное уравнение стационарной скорости для двухсубстратной реакции, протекающей через стадию образования тройного комплекса, содержит члены, в которые входят концентрации субстратов в квадрате. Фердинанд [54] показал, что эти квадратичные члены при соответствующих значениях констант скорости могут привести к появлению сигмоидной зависимости скорости реакции от концентрации любого субстрата. Этот механизм кооперативности можно в принципе отличить от механизма, описываемого равновесными моделями, по отсутствию кооперативного характера кривой насыщения при проведении

Контроль ферментативной активности 197

-^-й-

специального эксперимента по связыванию. На самом деле сделать это не так просто, поскольку хотя результаты экспериментов по связыванию интерпретировать гораздо легче, чем кинетические данные, их не удается получить с такой же точностью.

Отклонения от уравнения Михаэлиса—Ментен должны наблюдаться и для многих других механизмов с разветвленными путями [1391, однако эти отклонения могут быть настолько малыми, что обнаружить их не удастся, как этой было показано,например, Гулбински и Клеландом [61] для галактокиназы (разд. 3.7 и 5.2). В настоящее время не известно ни одного случая кооперативности ферментативной кинетики подобного рода, и, по-видимому, энзимологи будут продолжать использовать равновесные модели, пока это будет целесообразно.

Хотя кинетическая кооперативность не представляет особой ценности для единичных ферментов, кинетический контроль метаболических путей двумя или большим

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)