нако их легко найти из серии экспериментов, проведенных при различных s0. Один и» методов, позволяющих определить кинетические параметры, основан на построении графика зависимости величины отсекаемого отрезка на первичных графиках от s0; эта зависимость представляет собой прямую, наклон которой равен Km/VKp, а отрезок, отсекаемый от оси ординат, — Kjs/V. Хотя этот метод позволяет определить три кинетических параметра, используемые соотношения не очень удобны. Гораздо более изящным является излагаемый ниже метод — один из трех, описанных Дженнингсом и Ниманном [85].

Прежде всего следует отметить, что размерности величин ?/ln(s0/s) и (s0 — s)/ln(s0/s) совпадают с размерностями величин s0/V и s0 соответственно. Рассмотрим, к чему приводит экстраполяция ординаты ?/ln(s0/s) к значению (s0—s)/ln(s0/s), равному s0. Условие (s0—s)/ln(s0/s) = s0 для уравнения (8.9) дает

^ _ ± (1 - kjk,) ч + (1 + VJU -

где v0 — начальная скорость реакции. Таким образом, простая экстраполяция дает точку {s0; s0/v0}. Подобные точки определяются графически при исследованиях начальных скоростей. Строя линейные анаморфозы нескольких кинетических кривых на одном графике и проводя для каждой прямой описанную выше экстраполяцию, приходим к зависимости s0/v0 от s0, из которой

Анализ кинетических кривых

203

обычным путем могут быть получены параметры V и Км- Эта графическая процедура представлена на рис. 8.1.

Может показаться, что для построения такого простого графика, как график зависимости s0/v0 от s0, нет необходимости прибегать к столь трудоемкому методу. Однако у него есть много прей-

2 -

«о

Наклоны=/?л?*^уг

1

Наклон = 1/V

У\ 1 1 1 1 1 1 1 1

1-3 ^2Н 0 1 2 3 4 5 6 -Км S0-S

In (50/5)

Рие. 8.1. Определение кинетических параметров из серии кинетических кривых, полученных при различных значениях начальной концентрации субстрата s0 с помощью графика зависимости */ln (Vs) от (s^ — s)/ln(so/s). Предполагается, что фермент ингибируется продуктом реакции по конкурентному типу. Экспериментальные точки (черные кружки) рассчитаны из уравнения (8.9) при /См = 3,46, Кр — 6,55, V = 5,7 и значениях s0 в интервале от 1 до 6 (произвольные единицы). Значения s выбирались в интервале от 0,9 s0 до 0,2 s0 (что соответствует изменению глубины превращения субстрата от 10 до 80%) через каждые 0,1 s0 Точка, обозначенная квадратом, получается при каждом значении s0 экстраполяцией прямой, проведенной через вкспериментальные точки, к значению (s„ — s)/ln (s„/s), равному s„ (что соответствует нулевой глубине превращения). Эти экстраполированные точки лежат па прямой; ее вчклон равен 1/у, а на оси абсцисс и оси ординат соответственно она отсекает отрезки —/См и /См/У (см- Рис- 2-4)-

муществ: этот метод не только дает информацию об ингибировании продуктом реакции, но и позволяет определить значения величин ¦s„/i;0 более надежно, чем при обычных измерениях начальных скоростей. Экстраполяция к точке {s0; s0/v0] является достаточ-

204

Глава 8

но близкой и может быть проведена более точно и объективно, чем измерение наклона кривой, экстраполированной к нулевому моменту времени.

8.4. Ингибирование несколькими продуктами

В предыдущем разделе мы рассмотрели конкурентное ингибирование единственным продуктом. Однако в ходе ферментативной реакции может образовываться несколько продуктов, и в этом случае наблюдаемая константа конкурентного ингибирования будет представлять собой не константу ингибирования для какого-либо одного продукта, а обратное значение суммы обратных значений всех констант ингибирования продуктами. Следовательно, константа Кр, используемая в предыдущем разделе, должна быть заменена всюду на 1/(1/Кр + 1/Кд + ...). Это следует из уравнения (8.6), потому что в нем величина р/Кр. должна быть заменена на величину (р/Кр -j- q/Kq + ...). Последняя эквивалентна p(l/Kp + HKq + ...), если в начальный момент времени отсутствуют все субстраты, так как в этом случае-на всем протяжении р = q = ... .

Вполне естественно, что нам хотелось бы дифференцировать влияние различных продуктов на ход реакции; для этого можно добавлять разные количества того или иного продукта до начала реакции. Рассмотрим случай, когда ферментативная реакция имеет два продукта, Р и Q, из которых в начальный момент времени присутствует только один (Q) в концентрации q0. В таком случае-

dp =_V (s0 — р)_ щ

dt г /, , Р , Р + о.о\ ,

Проинтегрировав уравнение тем же методом, что и ранее, получаем

+[1-K»(-i+i-)](s»-s)-

Используя подход, изложенный выше, мы можем построить график зависимости t/ln(s0/s) от (s0 — s)/ln(s0/s) и далее, после экстраполяции, график зависимости s0lv0 от s0. В этом случае v0 представляет собой начальную скорость реакции в особых условиях, а именно для случая, когда в системе в начальный момент времени присутствует конкурентный -ингибитор Q в концентрации q0:

V° = #м(1 + ffo/*9) + «b • (8Л1)

Анализ кинетических кривых

205

Что касается параметра Кд, то его можно определить графически (гл. 4). Описанный подход используется не только в тех случаях, когда Добавляемый ингибитор является продуктом реакции. Если до начала реакции в систему внесен конкурентный ингибитор I, не являющийся продуктом реакции, в концентрации г, то для определения константы ингибирования Ki можно поступить следующим образом. Если в уравнении (8.10) заменить (Р + ao)IKq на HKi, то в уравнение, соответствующее уравнению (8.11), вместо qJKg будет входить ?//?,-, и'поэтому константа Доопределяется из точек, полученных экстраполяцией, как это описано в гл. 4.

8.5. Смешанное ингибирование продуктами

В гл. 5 указывалось, что ингибирование продуктом реакции совсем не обязательно должно быть конкурентным; более того, конкурентный тип ингибирования не является типичным. Более общим является случай, когда продукт представляет собой смешанный ингибитор с константами ингибирования Кр и Кр соответственно:

dp V (s„ — р)

dt KK{l+P/Kp) + (s0-p)(l+ р/К'р)

Это уравнение отличается от других уравнений, рассмотренных в этой главе, поскольку в знаменателе оно содержит член р2. Однако его можно все еще довольно просто проинтегрировать'

so — P

Следовательно,

~(К!Л + s0)ln(s0~ р)~^ +^r-~iyp + s0\n(s0~ р)]-

~ ~F~ [т (s°_ р)2 ~ 2s° (s° ~ р) + s°ln (s° ~~ р) ] = vt + а'

С учетом начальных условий (р = 0 при t = 0) это уравнение-легко упрощается:

Vt = (1 - KJKP)(S0S) + + Кк (1 + S0/KP) 1П (8JS).

206

Глава 8

Полученное уравнение отличается от уравнения (8.8) только тем, что оно содержит член (s0—s)2/2Kp', который становится бесконечно малым при Кр'-*- оо. Случаи чистого неконкурентного или бесконкурентного ингибирования можно получить, если подставить в уравнение Kv-^*- со или Кр = Кр' соответственно.

Из-за наличия квадратичного члена уравнение для случая смешанного ингибирования в координатах {(s0 — s)/ln(s0/s); ?/ln(s0/s)} не дает прямой:

м

In +

К

м

2К / ln(s0/s)

V

1 + ^.(8.12)

Наклон не является постоянной величиной, а меняется с изменением s, в результате чего прямые искривляются. Кривые в указанных координатах приведены на рис. 8.2. Однако, если Кр'

2

^?

1 Наклон=1/К

У\ 1 1 1 1 i-i Г 1

-з

-2 -1

3 4 In (5{/S)

Рис. 8.2. Использование метода, представленного на рис. 8.1, в условиях

смешанного ингибирования продуктами реакции. Значения констант те же, что и в подписи к рис. 8.1, однако введена дополнительная «онстанта к =8,27, а вместо уравнения (8.9) использовано уравнение (8.12). Переход

от конкурентного к смешанному типу ингибирования продуктами реакции не влияет на положение точек, которые находятся путем экстраполяции (квадраты), так как при вкстраполяции к нулевой глубине превращения субстрата эффекты ингибирования продуктом снимаются.

Анализ кинетических кривых

207

не слишком мала но сравнению с Кр, кривизна относительно невелика и становится заметной лишь при глубинах превращения субстрата 90 % и выше. Это обстоятельство приводит к двум важным последствиям. Во-первых, определение начальных скоростей путем экстраполяции может быть проведено достаточно точно, даже если смешанное ингибирование ошибочно принято за конкурентное. Во-вторых, можно не заметить существующей кривизны и получить неточные значения Кр. Это означает, с одной стороны, что смешанное ингибирование не мешает точной-оценке " параметров V м АГм, а с другой — что не следует определять константу Кр описанным способом, если не получено независимых доказательств конкурентного характера ингибирования. Кроме того, кажущийся линейный характер графиков зависимости t/]n(s0fs) от (s0 — s)/]n(s0/s) нельзя рассматривать как указание на определенную природу ингибирования продуктом. Для установления типа ингибирования лучше воспользоваться методом, описанным в предыдущем разделе для определения индивидуальных констант ингибирования продуктом и основанным на добавлении к реакционной смеси различных количеств продукта.

Форма кинетических кривых в общем довольно нечувствительна к виду уравнения, используемого для их описания. Другими словами, нередко ( и не только в рассмотренном выше-случае) экспериментальная кинетическая кривая может быть вполне удовлетворительно описана неверным уравнением. Желательно поэтому всегда проводить несколько экспериментов при различных начальных концентрациях субстрата точно так же, как это делается при исследовании начальных скоростей. Тем не менее было бы ошибочно думать, что, как считают некоторые исследователи, интегральные формы уравнений скорости не имеют преимуществ перед дифференциальными: детальный анализ кинетической кривой в целом всегда дает больше информации, чем оценка начальной скорости из тех же самых данных. Даже если интегральная форма уравнения скорости используется только для оценки значения начальной скорости, эта оценка, проведенная корректным образом, дает более надежное значение v0, чем метод определения начального наклона, поскольку, как мы уже говорили, в мет