оде интегральных кривых используется больше информации и он в меньшей степени подвержен ошибкам субъективного характера. Родственные методы определения начальных скоростей, основанные на использовании прямого линейного графика, обсуждаются в работе Корниш-Боудена [36].

8.6. Более сложные случаи

Выше мы рассмотрели только относительно простой случай необратимой односубстратной реакции, однако эти же принципы могут быть использованы и для анализа большинства основных

208

Глава 8

типов ферментативных реакций. Большая часть соответствующих уравнений интегрируется гораздо проще, чем обычно полагают. Для этого нужно быть лишь немного знакомым с интегральным исчислением, а не просто уметь находить стандартные интегралы в таблице. Альберти и Корбер [5] проанализировали интегральную форму уравнения для обратимого механизма Михаэлиса — Ментен и применили его к фумаразе. Шверт [131] получил интегральные формы уравнений скорости для ряда более сложных механизмов. Хотя интегрирование этих уравнений не представляет •особых трудностей, конечные выражения имеют обычно довольно сложный вид, и поэтому их анализ весьма трудоемок. Кроме того, интегральные уравнения так мало применялись в ферментативной кинетике, что дальнейшее более или менее детальное обсуждение этого вопроса нецелесообразно.

Даже если использование интегральной формы уравнения скорости недостаточно обоснованно (например, если не установлен механизм реакции или фермент теряет активность в ходе реакции), анализ кинетической кривой может быть весьма полезным. Вместо того чтобы искать истинное уравнение кривой, можно вос-тшльзоваться уравнением следующего типа:

/> = Po + Pi'+Ma + M3 + ---- (8-13)

Этим уравнением можно описать любую монотонную функцию одного параметра. Коэффициенты f>0, jjj, В2, В3 ... определяются по методу наименьших квадратов (гл. 10). Начальная скорость находится далее из уравнения

-J- = p1+2Pa*+3p, *»+.... (8.14)

at

Видно, что при t =0 v = р\. В принципе чем больше членов содержит уравнение подобного типа, тем лучше можно описать кинетическую кривую. Однако на практике при анализе кинетических кривых ферментативной реакции оказывается, что почти вся необходимая информация содержится в первых трех или четырех 'членах уравнения (8.13); члены с коэффициентом В4 и т. д. по порядку величины близки к случайной ошибке. Следовательно, члены, содержащие t в степени выше 3, брать не следует, во многих задачах для достаточно полного описания кривой вполне хватает предыдущих членов (см. [91]).

Метод определения v0 с помощью степенного ряда по t обладает своими достоинствами и недостатками. С одной стороны, этот метод можно применять независимо от того, известно ли истинное уравнение скорости; он пригоден и в тех случаях, когда процесс осложняется протекающей во времени денатурацией фермента. С другой стороны, подобный подход дает гораздо меньше инфор-

Анализ кинетических кривых

209

мации о кривой. Коэффициенты 60, Bj, Ва... не имеют физического смысла, и их нельзя преобразовать в параметры, связанные с механизмом ферментативного процесса. В частности, эти коэффициенты не равны соответствующим коэффициентам истинного уравнения скорости, представленного в виде бесконечного ряда (соответствие возможно только в том случае, если оба ряда являются бесконечными). Может показаться, что подстановка ряда значений t в уравнения (8.13) и (8.14) даст серию пар значений (р, v), которые можно будет перевести в пары значений (s, v) и проанализировать их при помощи обычных уравнений скорости. Однако такой подход некорректен: пары значений, полученные подобным образом, не являются статистически независимыми и к ним нельзя применять методы статистической обработки результатов измерений.

8.7. Некоторые предостережения

Анализ кинетических кривых — это путь, на котором исследователя могут подстерегать многие неожиданности. Именно поэтому большинство этимологов, не желая рисковать, ограничиваются рассмотрением только начальных скоростей. В настоящем разделе обсуждаются некоторые наиболее серьезные ошибки, встречающиеся при использовании интегральных форм уравнений скорости.

В простых случаях, которые рассмотрены в настоящей главе, конкурентное ингибирование продуктом реакции не влияет на вид интегрального уравнения скорости. Следовательно, если конкурентное ингибирование продуктом не учтено, то анализ единственной кинетической кривой не позволяет обнаружить ошибку. Это утверждение верно и для более сложных случаев, потому что конкурентное ингибирование продуктом приводит к появлению члена, содержащего р, в знаменателе уравнения скорости. Однако там уже имеется отрицательный член, содержащий р, так как концентрация субстрата всегда входит в знаменатель в виде (s0—р). Таким образом, член, соответствующий ингибированию продуктом, не влияет на вид интегрального уравнения скорости, если он не равен или не превышает члена, содержащего (s0—р). Полезно сформулировать этот вывод и в обратной форме: тот факт, что кинетическая кривая описывается уравнением, не учитывающим ингибирования продуктом реакции, не означает, что конкурентное ингибирование продуктом отсутствует. По э.той причине, если не доказано отсутствие ингибирования продуктом, следует всегда допускать его существование. Простой метод выявления ингибирования продуктом состоит в проведении экспериментов при различных значениях s0, как это обсуждалось в

1/28—282

210

Глава 8

раэд. 8.3. Важно подчеркнуть, что ингибирование продуктом может быть существенным для реакции, которая на практике является необратимой (см. разд. 2.7). Таким образом, если известно, что константа равновесия очень высока, это еще не означает, что мы можем пренебречь ингибированием продуктом.

Ошибочным является допущение о том, что набор скоростей, получаемый при измерении наклона в различных точках кинетической кривой, можно считать начальными скоростями, определенными при различных значениях sup. Например, казалось бы, определив s в различных точках, можно далее рассчитать скорость в середине интервалов между каждой парой точек как отношение разности значений s к временному интервалу. Этот подход можно рассматривать как обобщение очень распространенного когда-то ошибочного метода определения параметров линейных графиков. Он основывается на допущении, что набор наблюдаемых значений у1г у2, у3,..., уп, выбранных через равные промежутки, таков, что у является линейной функцией х. Считается, что далее можно рассчитать серию наклонов (у2—J/i)/Az, (Уз—УгУДя,---. (Уп—yn-i)/&x; и найти их среднее значение. Однако среднее определяется следующим выражением:

Измеряемый наклон = —-— (-У2~у - -|—уа~ Уг _|_ ... _|_

п — 1 \ Ai Ai

I Уп — Уп-Л = Уп — Vi Ai / (п — 1) Ai

из которого видно, что в конечную величину дают вклад только первый и последний члены. Кинетические кривые, встречающиеся в ферментативной кинетике, не могут быть проанализированы так же просто, однако сказанное выше справедливо и для них, и ясно, что в общем случае в методах описанного типа конечный результат мало зависит от промежуточных точек [34].

Не представляется целесообразным использование и другого, близкого подхода, основанного на нахождении полинома типа (8.13), наилучшим образом описывающего экспериментальные данные, и последующей подстановке в уравнение (8.14) различных значений t для получения набора значений скоростей. Соображения здесь несколько иные. Хотя в этом методе используются все данные, он тем не менее некорректен, потому что результирующие ошибки измерения скоростей связаны с самими измеряемыми величинами и не являются случайными. Все обычные статистические методы анализа данных требуют, чтобы наблюдения были независимыми. Если это условие не выполняется,

Анализ кинетических кривых

211

определяемые значения кинетических параметров могут тем не менее быть вполне правильными, однако любые оценки точности их определения становятся бессмысленными. Подход, основанный на применении полинома, является фактически методом «сглаживания» кривой, и он уничтожает большую часть информации о разбросе данных. Использование любой другой процедуры «сглаживания» (например, простого проведения плавной кривой через наблюдаемую линию или точки) наталкивается на те Же самые возражения. Всякий раз, когда применяется «сглаживание» (какой бы метод при этом ни был выбран), использование более чем одного значения из каждой кривой для любого последующего статистического анализа некорректно. Естественнее всего брать в качестве такой единственной величины начальный наклон, однако этого бывает недостаточно.

Здравый смысл подсказывает, что если для анализа кривой выбирается, скажем, 50 точек, то вряд ли точность существенно повысится, если увеличить число точек до 500. Сомнительно, что дополнительные 450 точек существенно дополнят ту информацию, которая содержится в первых 50. Однако если рассчитать кинетические параметры из 50 и 500 точек одной и той же кривой и затем, не вдаваясь в детали, применить к ним статистические формулы для расчета стандартных отклонений, то обнаружится, что для 5б0 точек ошибки намного меньше, чем для 50. Эта парадоксальная ситуация становится ясной, если вспомнить, что для статистических расчетов необходимы независимые наблюдения: если выбранные точки располагаются слишком близко друг к другу, то они не могут быть независимыми. К сожалению, Простого ответа на вопрос о том, как много точек необходимо брать для одной кривой, не существует. Если получение и анализ данных автоматизированы, то при выборе числа точек можно руководствоваться временем, необходимым для обработки данных при помощи ЭВМ, потому что включение большего числа точек, чем это необходимо, не повышает точности оценки параметров. Если же получение и анализ данных проводятся вручную, то, очевидно, разумно руководствоваться тем, чтобы не выполнять лишней работы. В большинстве подобных случаев для того, чтобы охарактеризовать кривую, по-видимому, достаточно приблизительно 10 точек и, конечно, не больше 20. Даже если число точек очень невелико, к оце