нке стандартных отклонений параметров следует подходить очень осторожно, потому что неясно, где находится то предельное число наблюдений, до которого их можно считать независимыми. В любом случае следует ожидать, что расхождения между кривыми будут намного больше расхождений между точками одной и той же кривой. Поэтому, если определение значений начальных скоростей проводится при помощи метода, описанного в разд. 8.3, разумнее всего рассмат-

»/а8

212

Глава 8

ривать каждое экстраполированное значение начальной скорости как единичное наблюдение, а каждый наклон — как единичное наблюдение при оценке константы, Кр-

Можно не сомневаться в том, что при соблюдении известной осторожности анализ полных кинетических кривых, несмотря на трудности, изложенные в этом разделе, дает ценную информацию и поэтому представляет собой важную область ферментативной кинетики.

Глава 9

Быстрые реакции

9.1. Ограничения метода измерения стационарных скоростей

Для удобства будем называть период реакции, предшествующий стационарному состоянию, переходным (transient phase). Термин «переходный» обычно применяют в физике и математике для обозначения членов типа Ае~*/Т, которые часто встречаются при решении дифференциальных уравнений. Эти члены достаточно велики при малых t и стремятся к 0, когда t становится много больше константы т, называемой временем релаксации. Как мы увидим ниже, члены типа Ае~'/Т всегда присутствуют в кинетических уравнениях, когда при их выводе не делается допущения о стационарности процесса.

Совершенно ясно, что для исследования очень быстрых реакций, у которых время полупревращения намного меньше 1 с, необходимо применять иные экспериментальные методы, чем при изучении более медленных реакций, поскольку обычно время смешивания реагентов составляет несколько секунд. На основе механических устройств для быстрого смешивания (таких, например, как устройство, используемое в методе «остановленной струи») можно разработать более или менее удобные подходы для изучения реакций с временами полупревращения порядка Ю-3 с, однако в случае более быстрых реакций требуются другие методы. Менее очевидным является тот факт, что кинетические уравнения для быстрых реакций имеют другой вид. У большинства ферментативных реакций стационарное состояние достигается очень быстро; можно считать, что оно существует в течение всего времени наблюдения 8а ходом реакции, за исключением первых секунд после смешивания. Большая часть уравнений, рассмотренных в этой книге, выведена в предположении стационарности. Однако быстрые реакции аналогичны переходному периоду реакции, предшествующему установлению стационарного состояния, и их нельзя описывать уравнениями стационарной скорости. Настоящая глава посвящена выводу уравнений скорости для переходного периода, однако прежде всего она полезна с точки зрения обоснования целесообразности изучения этого периода ферментативной реакции.

Хотя измерения стационарных скоростей исключительно важны для установления механизма ферментативной реакции, их

214

Глава 9

основной недостаток заключается в том, что в лучшем случае стационарная скорость многостадийной реакции представляет собой скорость наиболее медленной стадии. Измерения стационарных скоростей обычно не дают информации о каких-либо более быстрых стадиях, а если мы хотим выяснить механизм ферментативной реакции, то такая информация необходима. Как указывалось в гл. 5, экспериментатор, варьируя концентрации субстратов, может существенно изменять относительные скорости различных стадий реакции. Поэтому, несмотря на указанное ограничение, часто удается охарактеризовать более чем одну стадию. К сожалению, подобным путем не выявляются стадии изомеризации. Рассмотрим простой пример:

Е + А^ЕА^ЕР ^Е+Р.

k_t ?_j

Стационарная скорость для этого механизма дается уравнением

(2-18): v = 0>/л&)

которое содержит только четыре параметра и поэтому не дает возможности найти значения всех шести независимых констант скорости. Приведенное уравнение применимо также и для значительно более сложных механизмов, в которых взаимное превращение ЕА и ЕР происходит с образованием нескольких промежуточных соединений. Измерения стационарных скоростей не только не дают никакой информации об индивидуальных стадиях, но и не позволяют установить их число. В общем случае, как подчеркивалось в разд. 3.3, для любой части реакционного пути, который состоит из ряда стадий изомеризации промежуточных соединений, все промежуточные соединения в стационарной кинетике должны рассматриваться как единая форма. Это обстоятельство существенно ограничивает возможности метода измерений стационарных скоростей и является главной причиной целесообразности изучения кинетики переходного периода, для которой подобных ограничений не существует.

Может показаться, что те преимущества, которые дает изучение быстрых стадий, сделают исследования стационарной кинетики ненужными. Однако по ряду причин эти исследования, по-видимому, еще многие годы не потеряют своей актуальности. Прежде всего теория для стационарных стадий ферментативной реакции намного проще, а для измерений стационарных скоростей не требуется дорогостоящего оборудования. Кроме того, для проведения измерений в стационарной области нужны лишь незначительные количества фермента. Хотя это обстоятельство может обернуться недостатком, если при этом условия опреде-

Быстрые реакции 215

яения ферментативной активности сильно отличаются от условий, в которых фермент находится в клетке, оно останется решающим фактором при выборе метода исследования до тех пор, пока способы очистки ферментов не станут значительно более совершенными, чем сейчас. В связи с этим важно отметить, что большая часть исследований переходного периода реакций выполнена на ферментах, не представляющих особого интереса для метаболизма, например на химотрипсине, папаине, фицине и ли-

20

f5

10

5

0 5 10 15 20

Рис. 9.1. Неоднозначное описание результатов в случае экспоненциальных

функций.

Точки рассчитаны из уравнения #=5,1 ехр (—//1,3) + 4,7 ехр (—//4,4)+9,3 ехр (—//14,2), а сплошная кривая —из уравнения у = 7.32 ехр (—//2,162) +10,914 ехр (—//12,86).

зоциме; просто эти ферменты нетрудно получить в больших количествах. До тех пор пока подобные исследования нельзя будет проводить систематически с такими ферментами, как, например, фосфофруктокиназа и глутаминсинтетаза, методы изучения стационарной кинетики по-прежнему будут оставаться актуальными.

Следует также отдавать себе отчет в том, что при количественной обработке данных по переходному периоду реакции возникают большие трудности, связанные с неоднозначной трактовкой результатов («ill-conditioning»). Это означает, что даже в отсутствие ошибок измерений экспериментальные данные можно вполне удовлетворительно описать широким набором констант и, конечно, широким набором уравнений. Эта ситуация иллюстрируется рис. 9.1, на котором показаны совокупность точек и кривая, рассчитанные при помощи двух различных уравнений, которые обычно встречаются при анализе данных регистрации быстрой кинетики. Это означает, что вся дополнительная инфор-

216

Глава 9

мация, которую в принципе могут дать такие исследования, ускользает, если стадии не разделены достаточно сильно во времени.

Таким образом, все знзимологи, осознавая большие потенциальные возможности методов исследования переходного периода ферментативной реакции, не должны при этом полностью пренебрегать изучением стационарных скоростей.

9.2. Переходный период для механизма Михаэлиса — Ментен

В разд. 2.4 уравнение скорости для механизма Михаэлиса— Ментен было выведено без привлечения гипотезы стационарности, чтобы показать, что при определенных соотношениях кинетических констант стационарная скорость должна устанавливаться очень быстро. Рассмотрим теперь более детально переходный период для зтого механизма. Ранее было показано [см. уравнение (2.9) ], что скорость реакции можно представить следующим образом:

D if 23456769 10 т t, мс

Рис. 9.2. Приближение к стационарному состоянию для ферментативной реакции, подчиняющейся механизму Михаэлиса—Ментен.

В верхней части рисунка представлена зависимость скорости реакции от времени; пунктирной линией обозначена стационарная скорость (»стац). В нижней части показана зависимость концентрации продукта р от времени (временные шкалы одинаковы для обоих графиков). Приведенные зависимости рассчитаны при помощи уравнений (9.1) и (9.2) при *+, «= 50 ООО М-1 ¦ с-1. = 500 сг', к+ = 100 с~', s = 0,005 М и «, = 0.00001 M.

Быстрые реакции

217

Из этого уравнения видно, что вначале скорость равна нулю, но затем быстро растет, достигая стационарного значения по мере уменьшения экспоненциального члена. Проинтегрировав это уравнение и приняв во внимание начальные условия (р = О при t = 0), найдем зависимость р от: t:

Л+1« + fc-l + fc+2

_fc+i fc+2 eos (1 — e*P [— (fc+i5 + fc-i + fc+2) <]) , 2)

(fc+1s + + Л+2)2

Зависимость p от t, изображенная на рис. 9.2, представляется вначале вогнутой кривой, а затем, когда экспоненциальный член уменьшается до нуля, выходит на прямую, описываемую следующим уравнением:

р= - U--*-). (9.3)

fc+lS+ fc_l + fc+2 \ ' fc+lS + Л_! + fc+a )

Экстраполяция этого линейного участка до пересечения с осью t дает точку т = l/(k+1s + k+z). Зависимость 1/т от s изобра-

жается прямой с наклоном, равным к+1, и отрезком, отсекаемым на оси 1/т, равным (к_г + k+i), как это было показано Гутфройн-дом [62] на примере гидролиза этилового зфира бензоил-L-ap-гинина, катализируемого фицином.

9.3. «Начальный всплеск»

При изучении катализируемого химотрипсином гидролиза нитрофенилэтилкарбоната Хартли и Килби [72] обнаружили, что, хотя высвобождение нитрофенола происходит практически линейно во времени, экстраполяция прямой к начальному моменту (времени дает ненулевую точку пересечения с осью ординат. В связи с тем что выбранный субстрат оказался очень плохим, в этих опытах пришлось использовать высокие концентрации фермента, и величина отсекаемого отрезка,