называемого «начальным всплеском» («burst») концентрации продукта, была пропорциональна концентрации фермента. Эти данные согласуются с механизмом, в котором высвобождение продуктов происходите две стадии, причем нитрофенол высвобождается первым:

у

m

^+1 К+2 ^+3

E+S < - ES <* * EQ -^Е+0. (%т)

?-1 ч '

9—282

218

Глава 9

Если последняя стадия является лимитирующей, т. е. если ft+3 мала по сравнению с k+1s, к_г и к+2, то в стационарных условиях фермент почти полностью представлен формой EQ. Однако EQ не может образоваться прежде, чем не отщепится Р, и поэтому в переходный период Р может высвобождаться со скоростью, намного превышающей стационарную скорость. Можно ожидать, что количество Р, соответствующее начальному всплеску, должно быть равно, а не просто пропорционально количеству фермента. Это строго верно только в том случае, когда константа

существенно меньше других констант скорости. Если это усло: вие не выполняется, то величина отсекаемого отрезка будет меньше стехиометрического количества фермента. Для того чтобы показать это, рассмотрим вывод выражения для величины отсекаемого отрезка, проведенный Гутфройндом [62].

Если s настолько велика, что ее можно считать постоянной, и если k+1s много больше (fc_x+ й+2 + к+3), то спустя очень короткое время после смешивания схема ферментативного процесса будет иметь вид

так как можно считать, что реакция Е + S—>- ES протекает мгновенно и необратимо и концентрация свободного фермента становится пренебрежимо малой. Эта схема представляет собой простую обратимую реакцию первого порядка (разд. 1.4). Изменения концентраций комплексов ES и EQ во времени описываются следующими выражениями:

Р

Q

[ES]

gu {Кз + Ki ехр [— (Ka + Кз) *П Ka 4- ^+3

[EQ]

к

:+2 е0 {1 — ехр [— (к+2 + к+3) t]}

к+2 -f- к+3

Быстрые реакции

219

В стационарных условиях, т. е. когда величина t велика, экспоненциальный член становится пренебрежимо малым и эти два уравнения принимают более простой вид:

dp __ dq _ k+a k+3 e„

dt dt &+2 -f- Л+з

Однако для переходного периода величина dp/dt вначале существенно превышает dq/dt. Поэтому, в то время как изменение [Р] во времени обнаруживает «начальный всплеск», для изменения [Q] во времени наблюдается лаг-период (эти отклонения от линейности могут быть продемонстрированы экстраполяцией линейных участков до пересечения с осями координат). Проинтегрировав уравнения и подставив начальные условия (р = 0 и q = О при t— 0), получаем выражения для размеров отсекаемых отрезков:

= Кгк+Зе01 + *+2 е0 {1 — ехр [- (k+a + k+s) t] }

К* + К3 ' (fc+a + fc+3)2 ' '

q _ Кг к+3 е0 t___к+2 к+3 е0 {1 — ехр [— (fc+2 -j- к+3) t]} щ

Ki + Кз (Ki + Кз)2

Если принять экспоненциальный член в уравнении (9-5) равным нулю, то мы получим линейную часть зависимости р от t. Далее экстраполяцией к нулевому моменту времени находим величину начального всплеска л:

*+2 ео е0

(Кг + Кз)2

(9.7)

Таким образом, величина начального всплеска концентрации Р не равна концентрации фермента, а приближается к ней, если k+i ^ к+3. Из этого уравнения следует, что я никогда не может превысить концентрацию фермента. Однако экстраполяция «линейной» части кинетической кривой может иногда давать значения начального всплеска, превышающие истинное значение я. Это бывает в том случае, если скорость на стационарном участке реакции на самом деле не постоянна, а заметно снижается по ходу ферментативного процесса. Если же мы уверены, что кинетическая кривая на стационарном участке строго линейна, подобного искажения величины л быть не должно.

Аналогичным образом получают выражение для величины лаг-периода (т) при образовании продукта Q:

T=l/(fc+2 + fc+3).

Очевидно, что лаг-период будет заметным лишь в том случае, если константа й+2 по порядку величины близка к константе к+3.

9*

220

Глава 9

Длительность лаг-периода для обсуждаемого механизма ферментативной реакции не зависит ни от концентрации фермента, ни от концентрации субстрата. Это обстоятельство нозволяет легко отличить его от лаг-периода для обычного механизма Михаэлиса—Ментен, рассмотренного в предыдущем разделе.

т

0,2

1,0

0,4 0,6 0,8

t, произвольные единицы

Рис. 9.3. Кинетика с «начальным всплеском».

Представлены зависимости концентраций Р и Q от времени для ферментативной реакции, следующей механизму (9.4), при А+1 = 10, *+3 = 1 (в произвольных единицах) и насыщающих концентрациях субстрата, т. е. при (A-i + *+t 4- *+«)-

Для иллюстрации полученных результатов на рис. 9.3 представлены кинетические кривые накопления продуктов Р и Q для механизма (9.4), рассчитанные при ft+2 = 10ft+3.

Более строгий анализ механизма (9.4) без привлечения каких-либо допущений об относительных значениях констант скорости был проведен Ойллетом и Стюартом [123]. В полные выражения для концентраций продуктов входят теперь k+1s0 и к_г вместе с дополнительным экспоненциальным членом, который приводит к появлению очень короткого лаг-периода перед участком кинетической кривой, дающим начальный всплеск. Анализ этого случая представляет существенный теоретический интерес, но поскольку большого практического значения он не имеет, обсуждаться далее не будет.

Методы, рассмотренные в этом разделе, позволили разработать важный способ определения концентрации фермента. В общем случае задача по определению точной молярной концентрации

Быстрые, реакции

221

фермента является довольно сложной: скорости ферментативных реакций дают концентрации в единицах активности на 1 мл, которые пригодны для сопоставлений, но не для оценки истинных концентраций. Большинство других методов анализа основаны на определении, содержания белка и поэтому малоспецифичны. Однако из уравнения (9.7) видно, что если подобран субстрат, для которого константа скорости к+3 равна нулю (или очень мала), то величина начального всплеска (я) будет равна концентрации фермента. Когда й;+3 очень мала, хорошо определяется также конечная точка «титрования». Для первоначально изученных субстратов химотрипсина (и-нитрофенилэтилкарбоната и и-нитро-фенилацетата) константы скорости к+3 оказались слишком большими, чтобы можно было использовать указанный метод определения е0. Однако позднее Шонбаум, Зернер и Бендер ИЗО] показали, что при соответствующих условиях с торанс-циннамоил-имидазолом получаются прекрасные результаты. Этот субстрат очень быстро реагирует с химотрипсином с образованием ими-дазола и тракс-циннамоилхимотрипсина, однако стадия деаци-лирования протекает гораздо медленнее. Измерение количества имидазола, высвобождающегося при добавлении раствора химотрипсина, позволяет рассчитать количество фермента. Для других ферментов также были найдены подходящие реагенты для титрования (см. [9]).

Метод титрования активных центров, основанный на измерении начального всплеска, отличается от метода определения скорости ферментативной реакции тем, что он относительно нечувствителен к изменениям констант скорости. Для того чтобы получить воспроизводимые значения скорости ферментативной реакции, необходимо поддерживать строго определенные значения рН, температуры, концентраций компонентов буфера и т. д. В то же время при относительно больших изменениях константы 7с+2, вызываемых, например, химической модификацией фермента, величина начального всплеска остается неизменной, если только не уменьшается настолько, что ее уже не удается измерить. Таким образом, химическая модификация либо совсем не влияет на значение молярной концентрации фермента, получаемое описанным методом, либо вызывает снижение его до нуля. По этой причине метод титрования фермента был назван испытанием по принципу «все или ничего» [99].

9.4. Последовательности обратимых реакций

Существует два типа реакций, для которых уравнения скорости имеют точные решения. Один из этих типов — обратимая бимолекулярная реакция, например реакция взаимодействия фермента с субстратом

Е +S**ES.

222

Глава 9

Этот механизм обсуждался в разд. 1.4. Он имеет довольно ограниченное применение в биохимии, потому что столь простыми являются лишь очень немногие реакции. Даже для реакций, следующих этому механизму, чаще всего используются приближенные решения, рассмотренные в последующих разделах, потому что эти решения имеют широкую применимость. Тем не менее однажды использовалось и полное решение уравнения скорости для этого механизма — при описании связывания цианида цероксидазой [51].

Другой тип реакций, для которых существует точное решение уравнения, — последовательность п обратимых унимолекуляр-ных стадий

Х^Х^Х^ ¦•¦ ^Хп. (9.8)

То ограничение, что последовательность (9.8) образована уни-молекулдрными реакциями, не является, как это может показаться, препятствием к использованию этого механизма в случае ферментативных реакций: хотя они включают по меньшей мере одну бимолекулярную стадию, обычно удается создать условия, в которых бимолекулярная реакция может рассматриваться как реакция псевдопервого порядка. Уравнения скорости, описывающие обобщенный ферментативный механизм

Е + S ES4 ^ ES2 ^ ¦ • • ^ ES„ ^ Е + Р,

могут быть решены с хорошей точностью в том случае, когда выполняется одно из следующих условий:

1. Если s практически постоянна, а р практически равна нулю. Тогда первая стадия (Е + S->- ES^ является реакцией псевдопервого порядка и первой стадией в обратном направлении (Е + Р->- ESn) можно пренебречь. В этом случае справедливо уравнение (9.8).

2. Если реализуется стационарное состояние; тогда уравнения стационарной скорости можно проинтегрировать так, как это описано в гл. 8.

Для большинства ферментативных реакций какое-либо из этих условий выполняется на всех стадиях процесса. Решение для переходного периода (условие 1) всегда содержит члены типа е~*1х. Если самый большой из этих членов становится пренебрежимо малым, прежде чем произойдут заметные изменения концентрации субстрата, переходный и стационарный периоды ферментативной реакции могут анализироваться отдельно друг от друга. При этом, рассматривая переходный период, прене