брегают изменениями s, а при анализе стационарного участка допускают, что изменения концентраций промежуточных соединений происходят очень медленно.

Быстрые реакции

223

Существует третье условие, при котором также возможно точное решение уравнений скорости. Если реакция близка к равновесию, то все нелинейные члены в уравнении скорости включают произведения малых величин и, не слишком ухудшая точность расчета, ими можно пренебречь. Решения в этом случае близки по виду к решениям, получаемым при анализе переходного периода, и дают примерно такую же информацию, однако они часто гораздо более удобны с точки зрения постановки эксперимента. Эта ситуация обсуждается в конце настоящей главы.

Уравнение для схемы (9.8) имеет точное решение при любом числе стадий; мы же для простоты найдем здесь это решение для следующей конкретной схемы:

Х0 ? X, ? Х2. (9.9)

Запишем уравнение материального баланса типа

хо Ч~ xi Ч" хг — хпош (9.10)

и три уравнения скорости:

dxjdt = — k+i х0 + AljXj, (9.11)

dxjdt =k+ix0 — (k_i+ k+2) xi + k_2хг, (9.12)

dx2/dt — k+2 xi — k_ 2 x2 ¦ (9.13)

Без одного из уравнений (9.11)—(9.12) можно обойтись, так как их сумма равна первой производной уравнения (9.10), т. е. dx0/dt + dxjdt + dxjdt = 0. Таким образом, фактически мы имеем три независимых линейных дифференциальных уравнения, включающих три неизвестные величины. Прежде чем приступить к их решению, получим из них одно дифференциальное уравнение относительно одного неизвестного. Исключив величину х2 из уравнений (9.10) и (9.12), приходим к следующему дифференциальному уравнению:

dxjdt = k+i х0 — (k_t + k^) xt + k_2 (xmm —x0 — xt) =

= fc-2 *полн + (fc+i — fc+a) xo — (fc-i + fc+2 + fc-z) xi- (9-14)

Дифференцирование уравнения (9.11) дает '

d2 x0/dt* = — k+l dxjdt + k_t dxjdt. (9.15)

Подставляя (9.14) в (9.15), исключаем в последнем dxjdt и получаем

<Р x0/dt2 - — k+l dxjdt + k_t к_г хаоя„ +

+ (fc+i — fc-г) fc-i Ч ~ fc-i №-i + fc+з + fc-2) x\- (9-16)

224

Глава 9

Наконец, используя уравнения (9.11) и (9.16), исключаем xxi

(Р xjdt2 + (к+1 + + к+2 -f к_2) dxjdt -f

+ (к-\ к_2 -\- к+1 к+2 -\- к+1 к_2) х0 = к_г к_2 хполв .

Таким образом, мы получили уравнение вида d2x0/dt2 + PdxJdt-\--)rQx0 = R, которое имеет следующее решение:

x0 = Ai ехр (— t/tj) + А2 ехр (— t/-z2).

Здесь ^! и 42 — константы интегрирования, определяемые из начальных условий, а х1 и та выражаются следующим образом:

l/t1=-i-(P + Ур*-щ),

Если величина к_хк+2 мала по сравнению с (к_хк_2 + к+1к+2 + + к+1к_2), то эти решения упрощаются и принимают более удобный вид: —^

1/4= *+! + *_!, (9-17)

1/т2= fc+2 + Л_2 . (9.18)

В общем случае, когда последовательность обратимых реакций включает п унимолекулярных стадий, поступая так же, как и при анализе схемы (9.9), исключают все неизвестные концентрации, кроме одной. Для исключения первой неизвестной концентрации используется уравнение материального баланса, а каждая последующая неизвестная концентрация исключается дифференцированием по t. Поэтому конечное дифференциальное уравнение с одним неизвестным представляет собой линейное дифференциальное уравнение и-го порядка, решение которого содержит п экспоненциальных членов. В благоприятных случаях некоторые времена релаксации относятся к определенным стадиям, как в случае уравнений (9.17) и (9.18), однако бывает это очень редко.

9.5. Кинетика при возмущении равновесия

Один из самых плодотворных методов изучения быстрых реакций состоит в регистрации процесса релаксации системы к равновесию после небольшого возмущения. Особенно важным для ферментативной кинетики является метод температурного скачка, в котором смещение равновесия происходит в результате резкого повышения температуры. Используя относительно простые устройства, можно добиться повышения температуры на

Быстрые реакции

225

Ю°С за Ю_в с. Так как большинство кинетических параметров меняется при варьировании температуры, температурный скачок сопровождается обычно быстрой релаксацией к новому рав-1, новесию. Возможны и другие способы возмущения равновесия (например, скачок давления), однако они менее удобны, так как дают намного меньшие изменения кинетических параметров при сравнимых энергетических затратах. Однако принципы анализа кинетики релаксации одинаковы для всех способов возмущения.

Рассмотрим в качестве примера простую реакцию связывания

Е + S % ES .

есо + Ае Sco + As ХЛ + АХ

Если обозначить через и Хо окончательные равновесные

концентрации Е, S и ES соответственно, а через й;+1 и &_i — константы скорости после возмущающего воздействия, то мгновенные концентрации можно представить как (е<х, + Де), (sm + As) и (Хоо + Да;) соответственно. Скорость изменения х выражается следующим' образом:

dx/dt = k+i ( + Ае) ( -4- As) — Л_4 ( х^ 4- Да-) .

Однако dx/dt = dAx/dt и, исходя из стехиометрии реакции, Де = = As = —Дж. - Поэтому

dAx/dt = k+i ( — Да;) ( s^ — Да;) — k^ (х^ + Ах) . (9.19)

Поскольку в равновесии суммарная скорость реакции равна нулю, fc+ieooSoo= fc-i^oo. Далее, если Да; мало, то членом, содержащим ХАХ)2, можно пренебречь. В результате уравнение (9.19) упроща-

Еется: \

dAx/dt = — [k+l ( ex + sx) -b*_i] Д*.

Таким образом, мы получаем простое линейное дифференциальное уравнение, решение которого имеет следующий вид:

¦ Да; = Ах0 ехр {— ( ee + Sгде Да-0 — отклонение в начальный момент времени. Следовательно, если начальное возмущение равновесия мало, то процесс релаксации для одностадийной реакции описывается одним экспоненциальным членом с временем релаксации т, определяемым следующим выражением:

226

Глава 9

Так как величины е^,, s^n к_г/к+1 обычно можно определить независимым путем, измерение величины т позволяет найти индивидуальные константы скорости к+1 и к_х.

Аналогичным образом анализируются механизмы, включающие несколько стадий, хотя вывод соответствующих выражений более сложен. В общем случае для и-стадийного механизма процесс релаксации характеризуется п временами релаксации, если стадии не связаны термодинамически, как это имеет место, например, в схеме

Е + S ^ ES Е' +S*fcE'S

Хотя эта схема содержит четыре равновесные стадии, независимыми являются только три константы равновесия, четвертая однозначно определяется тремя другими. В подобных случаях число индивидуальных- времен релаксации равно числу независимых равновесий. Механизмы этого типа часто встречаются при связывании протонов.

Распространенным типом многостадийных механизмов является механизм, в котором за начальной бимолекулярной реак-дией следует несколько унимолекулярных стадий изомеризации:

Е + S ES *ъ E'S ^ E"S... .

Выражения для времен релаксации имеют тот же вид, что и в случае последовательности унимолекулярных стадий (разд. 9.4), за исключением того, что константа скорости к+1 в них заменена на константу скорости псевдопервого порядка для бимолекулярной реакции Е 4- S-*- ES, т. е. на к^е^ 4- sx).

Хотя метод скачка обсуждался здесь в приложении к релаксации к новому равновесию, он применим и к релаксации к стационарному состоянию:

Е +S^ ES ^Е + Р.

^стац "Г" А^ -^стац "Т" Алг

Скорость релаксации определяется следующим выражением: dAx/dt = к+1 (После введения условия стационарности к+1естацв0 = (&_i + + к+2)хстац и равенства, вытекающего из стехиометрии реакции, Де = —Дат, получаем

dAx/dt = — (k+i s0 4- + к+2) Ах.

Это уравнение имеет следующее решение:

Ах = Аа;0 ехр (— t/x).

Быстрые реакции

227

Время\релаксации т связано с константами скорости соотношением \

и аналогично времени релаксации для переходного периода реакции, следующего за быстрым смешиванием реагентов (разд. 9.2).

Метод быстрого смешивания и метод температурного скачка существенно различаются по интервалам экспериментально измеряемых времен релаксации. Даже в самых совершенных аппаратах для полного смешивания требуется не менее 10" 3 с, и их нельзя применять для измерения времен релаксации, меньших этой величины. При использовании метода температурного скачка все реагенты смешаны еще до возмущения, и лимитирующим фактором является время разогрева системы (около 10~6 с). Таким образом, этот метод позволяет измерить намного меньшие времена релаксации. В то же время из-за конвекционных эффектов метод температурного скачка неприменим для измерения времен релаксации, больших Ю-2 с, и, следовательно, он не может полностью заменить методы быстрого смешивания.

Метод температурного скачка и ряд других релаксационных методов были предложены Эйгеном [48], который вместе со своими сотрудниками распространил их на широкий круг химических и биохимических систем. К ферментным системам методы быстрой кинетики были применены Хаммесом и Фазелой [66, 67], которые изучили методом температурного скачка взаимодействие различных соединений с глутамико-аспартикотрансаминазой1. В последние годы Хаммес и сотрудники применили релаксационные методы для исследования большого числа ферментов (см. [65, 69]).

9.6. Возмущения синусоидального типа

Рассматривая метод скачка, мы подразумевали, что возмущение происходит мгновенно, однако более реальным является приближение, согласно которому каждая константа скорости изменяется по экспоненциальному закону, так что

т имеет порядок 10_6 с, а А определяется степенью возмущения. Это уравнение сводится к уравнению, соответствующему мгновенному возмущению (к = кж), если измерения проводятся при временах, больших 10""" с. Реакции с меньшими временами релаксации можно изучать при помощи возмущений синусоидаль-

1/т = s0 4- k_t 4-

fc+2

fc = &Jl;— Aexp(— t/r)].

1 Рекомендуемое' тривиальное название—аспартат — аминотрансфераза (КФ 2.6.1.1) (см. Номенклатура ферментов, ВИНИТИ, М., 1978). — Прим. перев.

228 Глава 9

ного типа. Их обычно создают пропусканием через реакционную смесь ультразвуковых волн с частотой 1014 с-1. Ультразвуковые волны, проходя через среду, вызывают локальные флуктуации температуры и давления. Хотя