в водных растворах флуктуации температуры очень малы, они оказывают гораздо большее влияние на кинетические параметры, чем флуктуации давления, потому что реакции в растворе характеризуются очень низкой чувствительностью к изменению давления. В том случае, когда флуктуации обоих типов совпадают по фазе, неважно, какие из них дают больший эффект. Если возмущения малы, то они вызывают пропорциональные изменения констант скорости. Поэтому для простой реакции связывания

Е + S ^ ES е s х

каждая константа скорости под действием синусоидальной ультразвуковой волны изменяется по синусоидальному закону:

Ki — \i (1 + A sin at), (9.20)

k_t = Л_! (1 + В sin at) (9.21)

где k+1 и — средние значения к+1 и й_1т ю — частота ультразвуковой волны,. А жВ — амплитуды. Уравнение скорости имеет следующий вид:

dx/dt = k+i es — k_t x. (9.22)

Если e, s и x — невозмущенные значения e, s и x, то из стехиометрии реакции следует, что

е — е = s — s — — (х — а;) = — Ах. (9.23)

Подставляя уравнения (9.20), (9.21) и (9.23) в уравнение (9.22), получаем

dAx/dt = k+i (1 4- A sin at) ( е — Да;) ( s — Да;) —

— k_t (1 + В sin Ы)(х + Ах). (9.24)

Далее, если невозмущенная система находится в равновесии (или в стационарном состоянии), то k+1es = к_хх. Величины Дат, А и В малы, поэтому членами, содержащими (Дат)2, ААх и БДат, можно пренебречь. Следовательно, уравнение (9.24) можно упростить:

dAx/dt 4-[&+1(e4-s) + Да; = к+1е s (А — В) sin a\t.

Быстрые реакции

Полученное выражение является простым дифференциальным уравнением, решение которого имеет следующий вид:,

/1 Л е в (А — В) I-sin cot — со cos cot I

Ax =-\-^-L + R exp (_ tfr). (9.25)

- + CO?

В этом выражении i? — константа интегрирования, а величина т определяется следующим образом:

— = \i( e + s) + ti-t

При f»^>T экспоненциальный член становится пренебрежимо малым и уравнение (9.25) упрощается:

. _ fc+i е s (А — В) (т sin cot— сот8 cos сот) Ла; 1 + со2т* '

Сопоставление этого уравнения с уравнением, описывающим изменение (недостигаемого) равновесного смещения,

Датравя = k+ie s (А — В) т sin (at,

показывает, что фактическое смещение колеблется с той же частотой, что и равновесное, но отстает от последнего на l/tg(coT) (сот в радианах) и имеет меньшую амплитуду:

"

В этом выражении аравн — амплитуда равновесного смещения: Яравн = Klels{A — B)x.

Эту ситуацию для различных значений сот иллюстрирует рис. 9.4. Когда величина сот мала, реакция в любой момент времени близка к равновесию. Однако, когда частота и величина сот растут, смещение отстает по фазе и его амплитуда уменьшается. При очень .высоких частотах смещение практически отсутствует.

Поскольку химические реакции по своей природе не колеблются около положения равновесия, наблюдаемое колебание обусловлено поглощением энергии ультразвуковой волны. Эта энергия пропорциональна квадратам амплитуды и частоты колебания. Следовательно, поглощенная энергия, отнесенная к длине волны, должна быть пропорциональна я2рави <*>/(1 + оН2), Эта функция имеет максимум в точке, где со = 1/т, и поэтому измере-

23 Глава 9

ние поглощенной энергии при различных частотах дает ххростой способ измерения я:. /

Метод поглощения ультразвука был использован для^изучения большого числа простых реакций, например сольватации глицина и родственных соединений [68]. Исследование ферментов этим методом наталкиваются на ряд экспериментальных труд-

Рис. 9.4. Синусоидальное возмущение констант скорости реакции связывания

Е + S ^ ES.

Пунктирная кривая изображает недостигаемое равновесное смещение А*, а сплошные — действительное смещение для трех значений an, указанных на рисунке.

ностей, связанных с тем, что для получения заметного поглощения ультразвука необходимы большие количества материала. Кроме того, смущает сложность интерпретации спектров релаксации. Однако можно не сомневаться в том, что метод поглощения ультразвука станет со временем наиболее ценным методом изучения очень быстрых стадий ферментативных реакций. В работе [251 он был использован для исследования конформационных изменений поли-Ь-глутаминовой кислоты. Полученные авторами этой работы результаты имеют ¦ прямое отношение к ферментативной кинетике. Это исследование и исследования простых систем важны для понимания ферментативного катализа, поскольку они позволяют дать разумные оценки скоростей многих элементарных процессов, таких, как сольватация, протонирование, депротони-рование и конформационные изменения макромолекул. Так, хотя при изучении сольватации глицина время релаксации ока-

Быстрые реакции

231

зал ось равным 2,5-Ю-9 с, это не означает, что во всех реакциях сольватация должна протекать так же быстро; можно лишь говорить о значениях скоростей сольватации, которых можно ожидать в других системах. Аналогичным образом определение времени релаксации для перехода спираль—клубок в поли-Ь-глу-таминовой кислоте (5 ¦ Ю-8—10 5 с) позволяет судить о скоростях конформационных изменений в случае ферментативных реакций.

Глава 10

Расчет констант скорости

10.1. Достоинства статистического подхода и пределы его применения /

>

На протяжении последних 40 лет большая часть экспериментальных данных по ферментативной кинетике представлялась в виде линейных графиков, описанных в разд. 2.5. Чаще всего для этих целей использовался график двойных обратных координат, т. е. график зависимости 1/v от lis. Однако именно он вызывает наиболее сильные нарекания со стороны статистики и дает весьма ненадежные значения Км и V. Несмотря на успехи, достигнутые в последние годы в разработке методов обработки экспериментальных данных, график двойных обратных координат по-прежнему очень популярен; отчасти зто объясняется тем, что он широко используется некоторыми ведущими энзимологами, не до конца, по-видимому, представляющими, каковы недостатки этого графического метода. С другой стороны, его популярность можно объяснить и тем, что этот метод несколько проще других.

В работах принципиального характера следует вообще отказаться от использования любых графиков и применять вместо них статистические методы анализа. Однако многие экспериментаторы считают статистические подходы утомительными и полагают,что те преимущества, которые они дают, не так уж велики, чтобы отказываться от применения более удобных графических методов. По этой причине целесообразно начать данную главу с рассмотрения достоинств статистического подхода и пределов-его применения.

Если бы все эксперименты были выполнены с идеальной точностью, то не было бы никаких возражений против использования графических методов анализа. Все зависело бы только от способности экспериментатора представить данные графически и правильно их проанализировать. Однако реальные измерения всегда имеют ту или иную ошибку, и главная задача статистического анализа состоит в том, чтобы свести до минимума последствия этого факта. Графические методы в общем случае не позволяют выполнить эту задачу до конца, поскольку, если экспериментатор проводит линию на глаз, он не в состоянии правильно учесть вес разных измерений, в особенности если последний меняется от точки к точке. Любая прямая, проводимая через серию точек на глаз, носит субъективный характер и дает менее точные значения параметров, чем прямая, построенная с использова-

Расчет констант скорости

233

нием статистических методов. Очевидно, если используемый метод дает неоднозначные результаты, это снижает достоверность тех выводов, к которым приходит экспериментатор.

Второе возражение против применения графических методов состоит в том. что они не дают никакой информации о точности измерения кинетических констант (исключение составляет прямой линейный трафик; разд. 10.9). Статистические расчеты намного превосходят графические методы в том отношении, что они позволяют оценить ошибки в определении кинетических констант, обусловленные случайным разбросом данных.

Рассмотрим, какого типа ошибки возникают при проведении эксперимента. Случайные отклонения бывают двух типов: они возникают либо в результате ошибки измерения, либо в результате неидентичности образцов. Суммарная ошибка измерения.включает неточности в отборе проб при помощи пипеток, шум прибора, неточности в снятии показаний с ленты самонисца и тому подобное. Многие знзимологи считают, что основной причиной случайных отклонений при регистрации ферментативной кинетики является ошибка измерения. Однако некоторые исследователи (например, Рейх [128]) полагают, что большое значение имеют и ошибки, связанные с неидентичностью образцов, а в отдельных случаях они становятся даже преобладающими: никто, например, не станет утверждать, что колебания в весе среди отобранных №0 крыс связаны с неточностью взвешивания; вместо этого экспериментатор сделает заключение, что крысы не одинаковы и их веса отклоняются, но не от «истинных» значений, а от некоторого идеализированного значения, характеризующего популяцию. Вопрос о том, имеются ли отклонения подобного типа среди молекул ферментов, остается открытым; даже если имеются, неясно7 приводит ли это к заметным колебаниям в составе «образцов», отбираемых из исходного раствора и содержащих многие биллионы молекул. Тем не менее так просто отрицать эту возможность нельзя. В частности, Рейх подчеркивал, что случайные отклонения в экспериментах по ферментативной кинетике слишком велики, чтобы их можно было объяснить погрешностями используемой методики и приборов.

Систематические ошибки также бывают двух типов. Ошибки первого рода обусловлены неудовлетворительным описанием экспериментальных данных,, а второго — факторами, одинаково влияющими на все измерения. Ошибки первого рода проявляются тогда, когда экспериментальные данные описываются неверно выбранным уравнением. Пусть, например, получены совершенно точные данные для фермента, подчиняющегося уравнению Михаэлиса—Ментен, но для их описания использовано уравнение кинетики первого порядка; тогда на проведенную наилучшим образом кривую попадут не все точки. Ошибки подобного типа, как

234 Глава 10

правило, в