мости d от v точки должны быть разбросаны внутри клинообразной полосы, а на графике зависимости d/v от v — внутри полосы, параллельной оси v, как это показано в нижней части рис. 10.1. Эта картина является, конечно, идеализированной, и на практике, чтобы четко определить ха-

Расчет констант скорости

249

рактер разброса точек, необходимо, чтобы их было не менее 50. Эту трудность можно обойти, комбинируя результаты нескольких экспериментов, проведенных при одинаковых условиях одним и тем же исследователем.

Иногда интуитивно ясно, что ни один из рассмотренных выше случаев не Подходит и лучше всего взять нечто среднее между ними,

используя веса и = (Км + s)/Vs. Тогда для описания эксперимен-

9 г

0 12 3 456789

5

Рис. 10.2. Влияние способа определения весов на оценки кинетических параметров.

Экспериментальные данные описаны уравнением Михаэлиса—Ментен при V = 18,41 и Кщ = Ю,41 (сплошная кривая) для случая простых ошибок н при V = 23,61 и Км = = 14,87 (пунктирная кривая) для случая относительных ошибок. Различия в значениях параметров для двух способов определения весов особенно существенны в тех случаях, когда данные являются неудовлетворительными (например, расположены в неподходящем ин ервале значений s, как в приведенном случае) или когда для описания экспериментальных данных используется ошибочное уравнение (например, не учитывается отчетливо выраженное субстратное ингибирование).

тальных данных можно приспособить метод, предложенный для постоянных весов. Соответствующее выражение для суммы квадратов имеет теперь следующий вид:

ss = 2j-~ S у3 е2/*2- (10-36)

»(*м+»)

Можно сопоставить это уравнение с уравнением (10.27) и принять во внимание проведенное выше обсуждение вопросов, связанных

10-282

250

Глава 10

с его применением. Если характер распределения ошибок совершенно не известен (как это и бывает на самом деле), вернее всего остановиться именно на этом способа определения весов, а ни на одном из описанных ранее.

Рис. 10.2 показывает, как выбор способа определения весов влияет на расчет «наилучших» значений V и Км- Следует особо подчеркнуть, что хотя две расчетные кривые, проведенные через экспериментальные точки, очень сходны, соответствующие им значения параметров плохо согласуются между собой*

10.5. Заключительные замечания об использовании графика двойных обратных координат

Мы можем подойти к результатам, полученным в последнем разделе, с несколько иных позиций, акцентируя внимание на проблеме проведения через экспериментальные точки прямой методом наименьших квадратов. В разд. 10.3 было показано, что в этом случае каждой точке (х, у) должен быть приписан вес, который обратно пропорционален дисперсии зависимой переменной у. Для графика двойных обратных величин зависимой переменной

является i/v, ее дисперсия равна a2(v)/v2v2, где v — рассчитанное-

значение v, т. е. v = Vs/(Km + Следовательно, если все скорости имеют одну и ту же дисперсию (допущение, как сказано выше, далеко не всегда справедливое), то соответствующие веса

для графика двойных обратных величин пропорциональны v2v2. Поскольку расчетные значения скоростей вначале неизвестны, мы можем использовать в качестве первого приближения веса у4, рассчитанные из наблюдаемых значений скорости. Затем мы

можем уточнять результат, используя веса v2v2 до тех пор, пока

данные не станут самосогласующимися, т. е. пока оценка Км при переходе от одного этапа приближения к следующему не будет оставаться постоянной. [Некоторые исследователи, например Кле-ланд [31], в качестве второго и последующего приближений предлагают использовать веса и4, однако это предложение основано на неверной форме уравнения (10.9) для дисперсии обратной величины и не дает улучшения результата первого приближения.1 Если для графика двойных обратных величин берут веса

v2v2, то расчеты и конечные результаты оказываются идентичными тем, которые получены в предыдущем разделе [уравнения (10.28)—(10*31)]. Это же относится и к графику зависимости s/v от s. Тогда возникает естественный вопрос: в каком смысле график двойных обратных координат хуже графика зависимости s/v от s? Основной недостаток графика двойных обратных коор-

Расчет констант скорости

251

динат состоит в том, что даже умеренному интервалу значений s соответствует огромный интервал значений весов: например, если s изменяется отО,2/(мДо 2Кцс одновременным изменением v от 0,167КдоО,667У, то вес меняется при этом в 256 раз. Совершенно ясно, что, глядя на график, невозможно приписать одной точке в 256 раз больший вес, чем другой. Следовательно, график двойных обратных координат не дает почти никакой информации об экспериментальной ошибке. Для графика зависимости slv от s

картина иная: соответствующие веса пропорциональны v2v2ls2 (или приблизительно v^/s2) и в том же интервале значений v изменяются в 3,24 раза. Поэтому визуальный анализ графика зависимости s/v от s дает разумное представление об экспериментальной ошибке.

В этой главе мы до сих пор имели дело с простыми ошибками, т. е. считали, что все скорости имеют одну и ту же дисперсию. .Рассмотрим теперь альтернативную гипотезу: допустим, что ошибки измерения v являются относительными. График двойных обратных координат по-прежнему является наименее удовлетворительным, однако различие между ним и другими линейными анаморфозами уменьшается: соответствующие веса для величины 1/у пропорциональны теперь v2 и меняются при изменении v от 0,167Кдо 0,667 V только в 16 раз, в то время как соответствующие веса для величины s/v пропорциональны v Is2 и в том же интервале значений v изменяются в 6,25 раза. Какой бы линейный график ни применялся в этом случае, соответствующие веса должны быть рассчитаны из наблюдаемых значений скорости. «Уточнение» результата на основе использования расчетных значений скорости [31] представляет собой на деле отход от простого и точного решения к трудоемкой аппроксимации.

10.6. Стандартные ошибки величин V и Км

Выражения для дисперсий величин Км/Vn 1/К легко получить

подстановкой в уравнения (10.20) и (10.21) а = Km.IV, b = IIV и х = s:

(10.37)

(10.38)

cov

(l/У, Км/v)

(10.39)

2 "> 2 и'*2 — (2 "*)'

10*

252

Глава 10

Эти уравнения одинаково хорошо применимы для любого способа

определения весов. Дисперсия величины V находится из уравнения (10.37) по формуле для дисперсии обратной величины (10.9):

o»(v).

1>*о2 y,w

3KcnZj (10.40)

2 и> 2 ws2 — (2 ws)z

Выражение для дисперсии величины Км получается из уравнений (10.37) — (10.39) по формуле для дисперсии отношения (10.8):

^1ад^=+«2=.. (10.4.)

эксп

Хотя это выражение выглядит довольно сложно, рассчитать дисперсию Км не составляет особого труда, так как все суммы, входящие в (10.41), были уже определены при нахождении V и Км-Во всех этих уравнениях величина с2эксп определяется как SS/(n—2) (разд. 10.3), и в каждом случае стандартная ошибка представляет собой квадратный корень из дисперсии.

Отметим, что из расчета стандартных ошибок величин V^ii

Км сразу не видно, что между оценками V и Км всегда существует сильная положительная корреляция. На самом деле фактическая

ошибка величины V сильно зависит от ошибки Км и наоборот. Следовательно, следует рассматривать точность определения двух параметров совместно, а не порознь. Далее, хотя можно в принципе рассчитывать совместную доверительную область как область, ограниченную контуром с постоянным значением SS (см., например, [32]), использовать этот метод для повседневной работы неудобно, так как соответствующие расчеты очень трудоемки. Рассмотрим поэтому другие подходы. Проще всего воспользоваться тем качественным фактом, что между величинами V и Км всегда существует отчетливо выраженная положительная корреляция и что вряд ли заметная положительная ошибка в одном параметре будет сопровождаться заметной отрицательной ошибкой в другом. Можно использовать и другую возможность — рассматривать стандартную ошибку величины KmIV, которую так же легко рассчитать при помощи уравнения (10.38), как и стандартные ошибки параметров V и Км- Относительная ошибка в расчете KmIV всегда меньше, чем для Км, и часто меньше ошибки для V. Поэтому целесообразно проверять, согласуются ли предполагаемые ошибки в расчете Км и V со стандартной ошибкой для KmIV-

Расчет констант скорости

253

Наконец, необходимо помнить, что при расчетах стандартных ошибок не учитываются те источники ошибок, которые смещают все точки в одну сторону. Они могут быть гораздо важнее источников рассмотренных нами ошибок, и нет никаких оснований полагать, что их влияние на V и Км будет согласованным. Так, зачастую оказывается, что изменения обоих параметров, происходящие день ото дня, намного выше стандартных ошибок, рассчитанных для измерений, выполненных за один день. Рассмотрим, например, следующую серию значений Км и стандартных ошибок, полученную в работе [82] для бактериальной нитроге-назы в пяти экспериментах: 0,131 + 0,016; 0,059 + 0,008; 0,102 ± 0,027 ; 0,09 ± 0,02 и 0,12 ± 0,03 атм азота. Стандартное отклонение между этими результатами составляет 0,028 атм азота. Таким образом, между самими опытами существует различие, не учтенное при вычислении индивидуальных стандартных ошибок. Более того, два крайних значения Км характеризуются наименьшими стандартными ошибками, так что кажется, что связь между рассчитанными и истинными ошибками для этих пяти значений очень слабая. Подобный результат отнюдь не является необычным (единственное, что здесь необычно, — это наглядность представленного примера), и он показывает, что к оценкам стандартной ошибки следует относиться с большой осторожностью. Поскольку неточность в определении концентрации фермента непосредственно сказывается на величине V, весьма вероятно, что для значений V будет наблюдаться еще меньшее согласие между вариациями, наблюдаемыми день ото дня, и оценками стандартной ошибки.

10.7. Общая линейная модель и ее приложения к более сложным случаям

Чтобы описать экспериментальные данные при помощи более слойшых уравнений, чем уравнение Михаэлис