о катализа, к сходным результатам пришел Лэнгмюр [102, 103], изучая адсорбцию газов твердыми телами. Подход Ленгмюра был значительно более общим, однако случай, который он назвал «простая адсорбция», очень близок к схеме связывания, предложенной Анри, с одной стороны, и Михаэлисом и Ментен — с другой. Лэнгмюр пришел к убеждению о существовании сходства между твердыми поверхностями и ферментами, хотя, по его представлениям, активной является вся поверхность фермента, а не какие-то отдельные области или активные центры^ Хитчкок [76 ] обратил внимание на сходство уравнений, описывающих связывание лигандов твердыми поверхностями и белками. Развитие этих представлений получило логическое завершение в работе Лайнуивера и Бэрка [106], распространивших идеи Хитчкока на область катализа.

2.3. Принцип стационарности

Как в схеме Михаэлиса и Ментен, рассматривающих первую стадию ферментативного катализа как равновесный процесс, так и в схеме ван Слейка и Куллена, считавших эту стадию необратимой, делаются малообоснованные и излишние допущения о константах скорости. Как мы видели, обе схемы приводят к одинаковым уравнениям скорости. Бриггс и Холдейн [18 ] проанализировали обобщенный механизм, который включает оба частных случая:

E + S 5± ES^i Е + Р.

А-1

е0 — х s х

Здесь

dx/dt = k+l (е0 — х) s—k_t х — &+я х. (2.4)

Введение в ферментативную кинетику

Если допустить, что достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна, т.е. dxldt = 0, то

Ki «о s = №+i s + fcM + Л+2) х. (2.5)

Следовательно,

х =--, (2.6)

и поэтому

v = k+s х = fe+* fc+ae°g . =-^tafsf-# (2.7)

- +8

Это уравнение можно переписать в более" общей форме

v = Vsl(KK + s), (2.8)

где константа /См, называемая константой Михаэлиса, определяется отношением констант (fc_i + k+2)/k+1, а величина V, называемая максимальной скоростью, — произведением &+2е0. Уравнение (2.8) является фундаментальным уравнением ферментативной кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса—Ментен. Это уравнение выполняется для многих механизмов, более сложных, чем механизм Михаэлиса—Ментен, однако в этих случаях выражения для /См и V имеют более сложный вид. Поэтому на самом деле нельзя считать, что /См всегда определяется просто как (fc_i + k+^lk+1,& V — как ki+e0. Величина V не является фундаментальной характеристикой фермента, поскольку она зависит от его концентрации. Если концентрация фермента известна, то целесообразно ввести величину Акат — каталитическую константу (или число оборотов), определяемую выражением VIе0. Для механизма Михаэлиса — Ментен kKar идентична константе k+i, однако в общем случае лучше пользоваться менее определенным обозначением, а именно Лках.

Графически уравнение (2.8) представлено на рис. 2.1. Кривая представляет собой равнобочную гиперболу с асимптотами s = —/См и у = Г. При достаточно малых s величина v прямо пропорциональна s:

и поэтому реакция имеет, очевидно, первый порядок по отношению к s. Необходимо ясно представлять смысл величины VlKu- она является константой скорости для реакции Е + S Е + Р при низких концентрациях субстрата и не должна рассматриваться просто как отношение величин У и /См- Когда s = /См» скорость

38

Глава ?

является «полумаксимальной», т.е. v = 0,5V. При очень высоких значениях s величина v приближается к У и реакция имеет, очевидно, нулевой порядок по отношению к s; при этих условиях фермент, как говорят, насыщен субстратом. В действительности величина v приближается к V очень медленно, и, даже когда s = = IOJCmi величина v составляет только 0,91V. По этой причине

S

Рис. 2.1. График зависимости начальной скорости v от концентрации субстрата s для реакции, подчиняющейся уравнению Михаэлиса — Ментен.

(Михаэлис и Ментен этот график не использовали и предложений применять его ие давали. )

значение V часто нельзя прямо измерить, его приходится рассчитывать из скоростей, наблюдаемых при значениях s ниже насыщающих. Определить точно асимптоты равнобочной гиперболы почти невозможно из-за того, что их стремятся провести слишком близко к кривой. Эту трудность можно обойти, если изображать результаты графически иным способом. Эти графические методы обсуждаются в разд. 2.5.

С практической точки зрения было бы очень заманчиво допустить, что константа Км является мерой истинной константы связывания Ks, т.е. что константа fc+2 пренебрежимо мала по сравнению с к_±. Однако в отсутствие доказательств, полученных каким-либо иным способом, это допущение нужно принимать с большой осторожностью. Значения индивидуальных констант k_t и к+2 определены лишь для небольшого числа ферментов. (Эти данные суммированы в обзоре Эйгена и Хэммеса [49 ]), и как раз для пероксидазы хрена (первого фермента, для которого были изме-

Введение в ферментативную кинетику

39

рены индивидуальные константы скорости) оказалось, что /с+2 [28]. Этот результат гораздо лучше согласуется с допущениями ван Слейка и Куллена, чем с допущениями Михаэлиса и Ментен. Особенно важно то обстоятельство, что существует много механизмов, более сложных, чем механизм, предложенный Бриг-гсом и Холдейном, приводящих к уравнению стационарной скорости, которое совпадает по виду с уравнением (2.8). В подобных случаях константа /См определяется более сложными выражениями, и нет никаких оснований считать, что эти выражения в реальных условиях всегда будут упрощаться до Ks- Фактически Км нельзя считать даже верхним пределом величины Ks [41 ]; это было бы справедливо в том случае, если бы подход Брштса — Холдейна был более общим.

После всех этих рассуждений у читателя может возникнуть вполне законный вопрос: какой смысл измерять Км> если ее нельзя использовать как характеристику прочности связывания субстрата? В действительности же измерять Км целесообразно по целому ряду причин. Во-первых, обычно при анализе какого-либо сложного механизма стремятся выразить сложные кинетические эффекты через простые величины, для этого исследуют изменение основных кинетических параметров (/См> V и VI/См) с изменением условий эксперимента. Во-вторых, /См полезна как параметр, обладающий предсказательной силой и позволяющий корректно поставить опыт по определению активности ферментов. При постановке таких опытов желательно, чтобы измеряемая скорость зависела только от концентрации фермента и была нечувствительна к небольшим отклонениям в концентрациях субстратов. В идеальном случае каждый субстрат поэтому должен испытываться в насыщающей (т.е. бесконечно большой) концентрации, однако на практике, чтобы скорость была нечувствительной к ошибкам в концентрации субстрата, достаточна концентрация, соответствующая 10 /См- Наконец, если Км рассматривается в совокупности с данными по измерению констант связывания для аналогов субстрата, выступающих в роли ингибитора (эти константы часто являются истинными термодинамическими величинами; см. разд. 3.7 и 4.2), она в некоторых случаях может интерпретироваться (конечно, с известной осторожностью) как мера Ks- Например, все три стереоизомера субстрата пепсина, ацетил-Ь-фенилаланил-Ь-фенилаланина, характеризуются константами конкурентного ингнбирования (К i), сходными по величине с /См Для этого субстрата [92], и в этом случае было бы неразумно настаивать на том, что Км не является характеристикой К s. Конечно, полученный результат нельзя рассматривать как доказательство того, что к+2 к-и °н скорее означает, что неверно обратное соотношение, к+2 ^ k_t. Км> по-видимому, равна К s также в тех случаях, когда она остается неизменной при

40

Глава 2

варьировании рН или концентрации эффектора, приводящем к изменениям величины V (этот вопрос рассмотрен в разд. 6.4).

2.4. Справедливость допущения о стационарном протекании реакции

Принцип стационарности был введен Боденштейном [14] для объяснения наблюдаемых скоростей фотохимических реакций определенного типа. Как мы видели, ван Слейк и Куллен [143] при выводе уравнений скорости ферментативной реакции считали само собой разумеющимся соблюдение стационарности, а Бриггс и Холдейн применяли этот принцип в явной форме. Ни один из этих авторов не получил строгого подтверждения выполнимости условия стационарности, и, к сожалению, появилась тенденция рассматривать принцип стационарности как самоочевидный или по крайней мере как всегда выполняющийся. В действительности этот принцип не выполняется в строгом смысле для нексм-торых некаталитических реакций типа

А + В С -»- D,

где на первый взгляд стационарность, как и в случае схемыБриг-гса—Холдейна, как раз должна иметь место. Допущение о стационарном протекании реакции стало главным допущением, лежащим в основе методов вывода большинства уравнений скорости, используемых в энзимологической химии, поэтому важно ясно понимать, что по крайней мере в случае механизма Михаэлиса— Ментен к нему довольно просто прийти.

Если не вводить допущения стационарности, то дифференциальное уравнение [уравнение (2.4) ] нельзя решить, принимая dxldt — 0. Вместо этого необходимо провести интегрирование:

Г_dx_

J *+l е0* — (k+lS + к-1 + fc+2> Х

Отсюда

In [fc+1 e0g — (fc+1s + k_y + fc+a) я]

— (fc+is + *U + fc+2)

В момент начала реакции промежуточное соединение отсутствует, т.е. х = 0 при t = 0, и, следовательно,

а _ In [к+1 e0s] — + *Li +

(k+ls +k_i+k+s)t.

J*.

= t + a.

что дает

|n K\ eo* — (k+is + k-i + k+i) x

Введение в ферментативную кинетику 41 Преобразуя выражение, получаем

fc+1 «о *

Следовательно,

fc+i gp« {1 — екр [— (fc+ts + fc_i + fe+a) <]}

a;:

fc+i» 4- fc_i + *+2 _ Vs {1—e»p[—

(2.9)

где У и /См определяются так же, тсак, и ранее, т.е. равны fc+2e0 и (fc_i + соответственно.. При достаточно больших зна-

чениях t, когда экспоненциальный член становится бесконечно малым, выражение (2.9) превращается в более простое уравнение стационарной скорости [уравнение (2.8)]. Значения г, при которых это происходит, зависят от величины (fc+Js + + й+г). Однако тот факт, что для большинства ферментативных реакций справедливо уравнение (2.8) (если не при