гониста (agonist) вызывает двухфазный Са2+-сигнал: кратковременный пик, связанный с мобилизацией Са2+ из депо (release) и выраженное длительное «плато», обусловленное входом Са2* из наружной среды (influx).

Справа: агонист добавляется к клеткам, находящимся в бескальциевой среде и регистрируется фаза мобилизиации Са2+ из депо (release). Далее в среду вводится 2 мМ Са"* и регистрируется фаза входа Са2* в клетку (по Zhu, Birnbaumer, 1998).

5.2. Механизмы мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо

Все клетки млекопитающих, за исключением эритроцитов, содержат органеллы, способные аккумулировать Са"* против электрохимического градиента. При соответствующих условиях Са2+ выходит из этих депо медленно (из митохондрий, секреторных гранул) или быстро (из саркоплазматического ретикулума (CP) мышечных клеток, Са2*-депо немышечных клеток). Са2+-запасающие органеллы, способные к быстрому обмену кальцием с цитоплазмой, содержат Са"*-буферные системы и Са"-каналы, по которым Са"+ освобождается из депо. 5.2.1. Са2* - депо мышечных клеток

В мышечных клетках Са~*-депо служит СР. Различают свободные, продольные цистерны CP и терминальные цистерны, контактирующие с впячиваниями сарколеммы (цистернами Т-системы). Структурная гетерогенность CP определяется различными функциями его отделов: продольные цистерны поглощают Са"* из миоплазмы. Терминальные цистерны способны к выбросу Са"* в ответ на деполяризацию сарколеммы. Мембрана CP содержит Са2+-АТФазу (мол. масса 110 кДа), осуществляющую сопряжение гидролиза АТФ с переносом Cai+. Са2+-АТФаза составляет 90% белков CP и транспортирует Са~т в стехиометрии 2:1 по отношению к АТФ. Са"'-АТФаза является классическим интегральным мембранным белком, имеющим 10 трансмембранных а-спиральных сегментов (М1-М10). в цитоплазме расположены домены Са2+-АТФазы, участвующие в фосфорилировании и связывании нуклеотидов (АТФ) (Mac Lennan et al, 1997) (рис. 24). Специфический ингибитор SERCA Са+-АТФаз тапсигаргин связывается с тарансмембранным сегментом МЗ. В связывании Са"+ участвуют трансмембранные сегменты М4, М5 и Мб. При связывании 1 молекулы АТФ с цитоплазматическим нуклеотид-связывающим доменом Са2+-АТФазы через мембарну CP в полость депо транспортируются 2 иона Са2+ (Mac Lennan et al, 1997). Са"+-АТФаза CP сердечных, скелетных и гладких мышц регулируется кислым протеолипидом фосфоламбаном (мол. масса 25 кДа). Молекула фосфоламбана состоит из пяти идентичных протомеров (мол. массой около 5 кДа), тесно контактирующих друг с другом и пронизывающих мембрану СР. Фосфоламбан связывает АТФ в стехиометрии 1:1 и может фосфорилироваться как цАМФ-зависимой протеинкиназой, так и Са~'-кальмодулин-зависимой протеинкиназой. Дефосфорилированный фосфоламбан связан с Са"+-АТФазой и ингибирует ее активность. Фосфорилирование фосфоламбана приводит к его отделению и активации АТФазы (James et al, 1989). Са2"-АТФазы в CP являются продуктами двух различных генов: SERCA 1 и SERCA 2. SERCA 1 АТФазы экспрессированы в скелетных мышцах, a SERCA 2 АТФазы в сердечных и скелетных мышцах (Pozzan et al, 1994; Hussain, Inesi, 1999).

Белок кальсеквестрин (мол. масса 42 кДа) и Са^-связывающий белок с высоким сродством к Са~т (мол. масса 55 кДа) локализованы внутри цистерн СР. Кальсеквестрин, кислый растворимый белок, содержащий много остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, составляет до 20% всего белка в терминальных цистернах скелетных мыши. Кальсеквестрин связывает большую часть (а'', поступающего в терминальные цистерны при работе Са"1-АТФазы. Одна молекула кальсеквестрина способна связать 43 иона Са"+. Этот белок служит основным Са"+-буфером в СР. В скелетных мышцах кальсеквестрин находится только в терминальных цистернах, в непосредственной близости к рианодин-чувствительному Са2+-каналу (Pietrobon et al., 1990). Локализация кальсеквестрина объясняется его функцией: белок не только служит буфером для Са2+ внутри терминальных цистерн, но и концентрирует Са2+ около Са2+-каналов, увеличивая тем самым скорость освобождения Са2+.

Phosphorylation Nucleotide binding

Ml №12 МЗ M4 MS Мб М7 MS MS М10

Рис. 24. Топология Са -АТФазы в мембране саркоплазматнческого ретикулума.

Трансмембранный домен белка включаег 10 а-спиральных сегментов (М1-М10). В цитоплазме локализованы домены, участвующие в фосфорилировании (phosphorylation) и связывании нуклеотидов (nucteotide binding). В связывании Са"* участвуют трансмембранные сегменты М4, М5 и Мб (по Mac Lennan et al., 1997).

5.2.1.1. Биофизические характеристики и регуляция рианодин-чувствительных Са2+-каналов

Са^-каналы в мембранах терминальных цистерн, специфически связывающие растительный алкалоид рианодин, служат объектом интенсивных исследований. Выяснение электрофизиологических и биохимических характеристик этих Са"+-каналов важно для понимания

I

связи между возбуждением и сокращением в мышцах. Алкалоид рианодин в концентрации 5-50 нМ увеличивает вероятность открытого состояния канала выброса Са21", а в микромолярных концентрациях блокирует канал (Bull et al, 1989).

Использование метода локальной фиксации потенциала позволило исследовать работу одиночных каналов Са"*-выброса после слияния пузырьков CP с бислойной липидной мембраной. Са2+-каналы имеют высокую проводимость для Са"1 (100 пСм) и низкую селективность для двухвалентных ионов по сравнению с одновалентными: РСа2+/Рк+=5. Са"+ (мкМ), АТФ (мМ) и инозитол-1,4,5-трисфосфат (1Р3) (мкМ), добавленные со стороны цитоплазмы, увеличивают время открытого состояния каналов в CP скелетных мышц. В результате совместного действия Са-" и АТФ канал может находиться в открытом состоянии длительное время. Каналу свойственны, по крайней мере, шесть закрытых и шесть открытых состояний, активируемых лигандами (Meissner, 1994).

Са2т-каналы в мембране CP активируются цитоплазматическим Са2+ (0,5-1,5 мкМ), АТФ (1-5 мМ), кофеином (мМ), 1Р3 (мкМ); ингибируются Mg2+ (мМ), рутениевым красным (мкМ) и La3+ (0,5 мМ) (Meissner, 1994; Xu et al, 1999). Эффекти