белка. Таким образом, G-белки представляют собой систему с регуляцией по принципу отрицательной обратной связи (рис. 6). При последующей активации рецепторов и связывании ГТФ а-субъединицей цикл повторяется снова (Sternweis, Pang, 1990; Neer, 1995; Sprang, 1997).

Важным свойством G-белков, позволяющим эффективно изучать их участие в тех или иных внутриклеточных процессах, является возможность их необратимой активации (или инактивации), минуя стадию стимуляции рецептора агонистом. Необратимую активацию G-белков вызывают негидролизуемые аналоги ГТФ: ГТФуя (гуанозин-5'-0-(3-тиофосфат)) и riv№-P(NH)P (5'-гуанилилимидодифосфат) (Gilman, 1987). К необратимой инактивации G-белков приводит их связывание с негидролизуемым аналогом ГДФ - ГДФ(35 (гуанозин -5'-0-(2-тиодифосфат) (Birnbaumer et al., 1990а, 1990b).

Чрезвычайно полезным для изучения роли G-белков в активации клеток оказалось применение таких природных бактериальная ядов, как XT и КТ, которые АДФ-рибозилируют G-белки (Birnbaumer et al., 1989, 1990a). XT приводит к постоянной активации аденилатциклазы, действуя на as-субъединицу и подавляя ее ГТФазную активность. КГ. наоборот, ингибирует активность агсубъединицы.

Рис. 6. Регуляторный цикл гетеротримерного G-белка.

Активированный лигандом рецептор (1) катализирует освобождение связанного с а-субъединицей G-белка ГДФ (GDP) и связывание ГТФ (GTP), что приводит к активации G-белка (2). G-белок диссоциирует на a-ГТФ и Ру-димер (3), которые активируют или ингибируют различные белки-мишени в клетке (4). Деактивация комплекса a-ГТФ происходит при гидролизе ГТФ до ГДФ (5). Гидролиз ГТФ превращает активированные a-ГТФ комплексы в неактивные а-ГДФ комплексы. а-ГДФ связывается с Ру-димером с образованием неактивного гетеротримерного G-белка (6).

a, Р, у - субъединицы G-белка.

Удобным инструментом для изучения G-белков является комплекс AlFy. Показано, что он необратимо активирует G-белки типов Gs, G, и G, (Cockcroft, 1987; Gilman, 1987). Считается, что A1F4" имеет структуру, сходную с фосфатной группой, и может взаимодействовать с ГДФ, связанным с а-субъединицей G-белков. Таким образом, A1F4" активирует а-субъединицу G-белка, связываясь с ГДФ и имитируя присоединение третьего фосфата (Bigay et al., 1987).

Установлено также, что G-белки являются субстратом для модификации такими эндогенными энзимами, как протеинкиназа С (Рупе et al., 1989). Кроме того, G-белки подвержены прямой рецептор-независимой активации катионными амфифильными нейропептидами (субстанция Р) и пептидами из яда насекомых (Mousli et al., 1990).

3.3. Связь G-белков с мембраной

В первичной структуре всех субъединиц G-белков отсутствуют гидрофобные, пронизывающие мембрану домены, и до недавнего времени оставались неясными молекулярные механизмы связи G-белков с мембраной. В то же время было понятно, что связь G-белков с мембраной является необходимой для обеспечения соответствующей ориентации компонентов цепи передачи сигнала. В последние годы было установлено, что для ассоциации G-б^дков с мембраной важно ацилирование G-белков жирнокислотными радикалами, что, как известно, сильно увеличивает гидрофобность белков. Выявлены два типа липидных модификаций субъединиц G-белков - миристоилирование и изопренилирование белковой цепи (Spiegel etal., 1991).

Большинство а-субъединиц ведут себя как интегральные мембранные белки: они не выделяются из мембраны при действии буферов с разной ионной силой (Buss et al., 1987), но освобождаются при воздействии детергентов или высоких рН (Audigier et al., 1990). Парадоксально, но очищенные а-субъединицы ведут себя как гидрофильные белки, так как не могут связываться с искусственными фосфолипидными пузырьками в отсутствие Ру-комплекса (Stemweis, 1986). Это послужило основой для предположения о том, что Ру-комплекс может служить якорем для а-субъединицы в мембране. Если это так, то можно было бы ожидать, что активация G-белка и диссоциация а-субъединицы от Ру-комплекса будут приводить к освобождению а-субъединицы из мембраны. Однако было показано, что активация мембранно-связанных G-белков даже при действии негидролизуемого аналога ГТФ (ГТФув) приводит к очень медленному освобождению а-субъединиц или освобождения не налюдается совсем (Milligan et al., 1988). Очевидно, что а-субъединицы могут связываться с мембраной независимо от Ру-комплекса. Воздействие трипсина на обработанные ГТФуБ мембраны вызывает освобождение растворимых а-субъединиц, у которых отсутствует N-концевой фрагмент (1-2 кДа), что свидетельствует о том, что а-субъединицы связаны с мембраной своим N-концевым участком (Eide et al., 1987). 4. Структурно-функциональная организация сигнальных систем в

клетках

4.1. Дденилатциклазный путь передачи информации

Во всех клетках животных и растений имеются два основных пути передачи сигнала, различающихся по вторичным посредникам -аденилатциклазный и фосфоинозитидный. Эти пути передачи сигнала имеют много общего. В обоих случаях информацию от первого звена рецептора получают и передают через мембрану в цитоплазму так называемые G-белки, активирующиеся при связывании гуанозинтр и фосфата (ГТФ). G-белки активируют "у'би^пйтельный" фермент на внутренней стороне мембраны, который способствует превращению молекул вещества-предшественника в молекулы вторичного посредника. Конечные стадии разных способов передачи сигналов сходны: вторичные мессенджеры вызывают изменение структуры клеточных белков.

Концепция сигнализации с участием вторичных мессенджеров появилась с открытием Сазерлендом роли циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в процессе гликогенолиза (Sutherland, Rail, 1958; Sutherland, 1972). В дальнейшем была показана важная роль цАМФ в регуляции различных клеточных процессов, таких как пролиферация, секреция, сокращение, мембранный транспорт, нейропередача, малигнизация клеток и т.д. Было обнаружено, что влияние на внутриклеточный уровень цАМФ характерно для целого ряда гормонов и медиаторов.

В аденилатциклазном пути передачи информации внешний