Биологический каталог




Основы общей биологии

Автор Э.Гюнтер, Л.Кемпфе, Э.Либберт, Х.Мюллер, Х.Пенцлин

й плазмидной ДНК, переходит в реципиента. ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента и в результате рекомбинации некоторые части одной цепи ДНК реципиента заменяются отрезками ДНК донора. Перенос всего генома длится у Е. coll около 100 мин. В большинстве случаев он прерывается раньше, что можно также вызывать экспериментально.

10.2.3.2. Трансдукция — это перенос бактериальных генов фагами (3.1.3). Умеренные фаги отличаются тем, что их ДНК может включаться в специфические участки бактериального генома (опять-таки по модели Кэмпбелла, рис. 10.12,5). В результате так называемой индукции ДНК фага освобождается. При этом возможна рекомбинация, в результате которой часть фаговой ДНК заменяется бактериальной ДНК (ДНК донора) и образуется дефектный фаг. При заражении таким фагом других бактерий (реципиентов) в клетку реципиента попадают включенные в геном фага гены бактерии-донора. Здесь они встраиваются в бактериальный геном вместе с фаговой ДНК (специализированная трансдукция). В данном случае реципиент будет диплоидным по встроенной части генома. Если донор и реципиент генетически различны, то реципиент после переноса гена становится гетерогенотным. Он может, например, содержать аллель дикого типа и мутантный аллель. В гетерогенотной области возможна внутрихромосомная рекомбинация между аллелями донора и реципиента — части донорского генома обмениваются с соответствующими частями генома реципиента.

Наряду с такой специализированной траисдукцней, при которой переносятся только гены, примыкающие к месту включения фага, существует неспе-цнфическая трансдукция—любой геи бактерии-доиора может быть упакован в оболочку фага и передай бактерин-рецнпиенту прн ее инфекции. При этом аллели встраиваются рекомбинативно в обмен на аллели реципиента нли передаются дальше от клеткн к клетке в качестве свободных частиц, без репликации.

10.2.3.3. Трансформацией называют процесс, при котором внеклеточная ДНК проникает в клетку реципиента и встраивается в геном. Для этого донорская ДНК должна быть двухцепочечной, а реципиент должен находиться в надлежащей стадии. В реципиенте донорская ДНК становится одноцепочечной и ре-комбинируется с клеточным геномом. С помощью трансформации можно также перенести плазмидную или вирусную ДНК. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти, продолжая направление исследований Гриффита (Griffith, 1928), в 1944 г. в экспериментах с трансформацией получили доказательства того, что ДНК служит носителем генетической информации. Они показали, что бескапсульные бактерии после поглощения ДНК из инкапсулированных бактерий приобретают способность образовывать капсулы.

10.2.4. ГИБРИДИЗАЦИЯ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Слияние генеративных клеток при оплодотворении ведет к образованию зиготы, в которой два гаплоидных ядра сливаются в одно диплоидное (8.2). При слиянии вегетативных клеток ядра могут оставаться обособленными, и тогда получается гете-рокарион (гибридная клетка с двумя или несколькими генетически различными ядрами), или же ядра сливаются и образуется синкарион. Вегетативные клетки могут сливаться у грибов (естественный процесс, ведущий к рекомбинации, соматога-мия; 8.2.3.1), у животных, у растений (в случае протопластов — изолированных клеток без оболочек) и у бактерий.

В таких гибридных клетках репликация и мнтоз могут осуществлнться в разных ядрах несколько по-разному. На протяжении ряда клеточных генераций происходит потеря отдельных хромосом и отбираются определенные

316 Глава 10

Наследственные изменения 317

кариотипы, способные затем сохраняться в течение многих клеточных поколений. Гибриды клеток мышн н человека утрачивают часть человеческих хромосом. В экспериментах с такими клеточными клонамн можно установить, какие типичные для клеток человека функции еще сохраняются; сопоставление этих функций с оставшимися хромосомами позволяет картировать гены человека (определять их локализацию в определенных хромосомах).

Такого рода гибридизация возможна и между клетками очень различных организмов; например, клетки человека могут сливаться с клетками комара или даже растительными протопластами.

Из продуктов слияния вегетативных растительных клеток в некоторых случаях развиваются взрослые растения.

10.2.5. РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК

Рекомбинантная ДНК ?— это результат экспериментального объединения ДНК различного происхождения, естественная рекомбинация которых сильно затруднена или вообще пока не наблюдалась. Цель таких экспериментов — включение определенных последовательностей в «вектор» для их размножения (репликации) в подходящем хозяине (рис. 10.14,Л). Размножение, в результате которого получается много идентичных копий, называется клонированием (8.2.5).

Вектор («носитель» размножаемой последовательности) должен быть репликоном (6.1). Как выяснилось, эффективными векторами могут служить плазмиды.

Из плазмид практическое значение имеют ColEl и pSClOl, а также их производные н комбинации, из вирусов — X, SV40H нх производные. Плазмида, используемая в качестве вектора, должна содержать детерминант какого-либо признака, чтобы факт ее передачи можно было установить по фенотипу. ColEl имеет то преимущество, что это очень небольшая плазмида н что при воздействии хлорамфеникола она размножается независимо от бактериального генома н в клетке может быть до 1000 ее копий. Плазмида pSClOl не обладает повышенной способностью к размножению, но зато содержит фактор устойчивости к тетрациклину. В векторе pBR322 (рис. 10.14,6), чаще всего используемом в настоящее время, объединена способность к репликации, свойственная ColEl, с устойчивостью к тетрациклину pSClOl и, кроме того, в нее введен дополнительный детерминант устойчивости.

Нужную последовательность ДНК можно получить после расщепления на фрагменты более длинной исходной ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз; одну из таких нуклеаз используют и для расщепления вектора. Рестрикционные эндо-нуклеазы — это ферменты, которые надрезают ДНК в специфических узнаваемых ими местах. Эндонуклеаза EcoRI (из EscheGAATTC

richia coli с R-плазмидой) узнаёт последовательность СТГАДО и специфически разрезает ее между G и А, так что образуется «липкий» (способный к связыванию) конец СТТАА"

Рис. 10.14. Рекомбинантная ДНК.

A. Получение и перенос рекомбинантной ДНК. 1 — бактерия с плазмидой, содержащей два гена устойчивости, Л+ н В+\ 2— выделение плазмиды

(как вектора для клонирования); 3— ДНК, подлежащая клонированию;

4 — получение рекомбинантной ДНК; 5— трансформация; 6 — бактерия с

плазмидой, содержащей геи устойчивости А+ н ген-маркер Х+. Г — геном;

Пл — плазмида; Э — места разрезания рестрикцнонной эндонуклеазой; Рек —

рекомбинантная ДНК.

Б. Плазмида pBR322. Ар1, Тс' — гены устойчивости к ампициллину и к тетрациклину; начало — место старта репликации; остальные надписи означают места разрезания соответствующими рестрикционнымн эндонуклеаза-ми; цифры — длина ДНК в кнлобазах (1 КБ = 1000 пар оснований).

B. Образование соматостатина в клетках Е. coli после включения химически синтезированного гена в плазмиду pBR322, служившую вектором ДНК;

перед этим геном была включена начальная часть лактозного оперона (lac)^

содержавшая промотор (Пр), оператор (О) н ген В-галактозидазы (fi-Gal).

318 Глава 10

Объединение вектора с фрагментом, содержащим нужную последовательность, осуществляют: 1) при помощи «липких» концов, образующихся после расщепления ДНК эндонуклеазой;

2) путем дополнительного синтеза dA-олигонуклеотида на конце одной ДНК и dT-олигонуклеотида — на конце другой или

3) путем соединения «гладких» концов при помощи Т4-лигазы:

1. ..G рААТТС.З' 5'...GAVrTC...3'

+ ?

3'.. ..СТТААр G...5' 3'...CTTAAG...5'

2. 5'.. ,. GCAAA AAA pTG...3' 5'.. .GCAAAAAATG. ..3'

+ ?

3\ ..CGp TTTTTTAC.. .5' 3'...CGTTTTTTAC...5'

3. 5'.. ..ACT pGTA...3' 5'...ACTGTA...3'

+ 3'. .. TGAp CAT...5' 3'...TGACAT...5'

Полученный продукт рекомбинации вводят в клетку чаще всего методом трансформации.

Получение рекомбинантной ДНК — это один из методов молекулярной биологии, позволяющий решать различные теоретические н практические вопросы. Приведем несколько примеров, иллюстрирующих многообразные возможности применения этого метода.

Быстрая репликация специфической ДНК позволяет получать ее в значительных количествах; это облегчает определение нуклеотидных последовательностей и таким образом делает возможным выяснение структуры операторов, промоторов, мест начала репликации н некоторых генов. Практическое значение может иметь бактериальный синтез веществ, которые получали до сих пор только из эукариотических организмов (например, синтез гормона соматоста-тина с помощью Е. coli; рис. 10.14, В). Способность клеток прокариот синтезировать определенные вещества можно значительно повысить. С помощью векторов SV40, встроенных в хромосому 7 человека, изучают экспрессию генов в культурах клеток обезьян.

Для того чтобы получаемая таким образом ДНК не могла вызывать нежелательных последствий, подобные работы ведутся при соблюдении соответствующих мер предосторожности.

Литература

Freye Н. A. Humangenetik, 3. Aufl., Verlag Volk und Gesundheit, Berlin, 1981. Geipler E. (Hrsg.). Desoxyribonucleinsaure, Schliissel des Lebens, 2. Aufl., Akademie-Verlag, Berlin, 1972. Giinther E. GrundriB der Genetik, 3. Aufl., Fischer, Jena, 1978. Kaudewitz F. Molekular- und Mikrobengenetik, Springer, Berlin, 1973. Stahl F. W. Mechanismen der Vererbung, Fischer, Stuttgart, 1969, Lizenzausgabe

bei Fischer, Jena, 1969. Theile M., Scherneck S. Zellgenetik, Akademie-Verlag, Berlin, 1978. Witkowski R., Herrmann F. H. Einfiihrung in die klinische Genetik, AcademieVerlag, Berlin, 1976.

Глава 11

ЭВОЛЮЦИЯ

пл. сущность эволюции

Каждый отдельный организм претерпевает развитие (индивидуальное развитие, онтогенез). Кроме того, в длинном ряду поколений от предковой формы до потомков возникают насле

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

Скачать книгу "Основы общей биологии" (4.30Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2018)