ную ШИК-реакцию, окрашиваются Суданом черным В, но не окрашиваются кислым гематеином. Идентификация ну-клеопротеидов возможна по их ортохроматическому окрашиванию толуидиловым синим при рН 4,2 или по различной окрашиваемости метиловым зеленым — пиронином.

3.1.2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

О наличии нуклеиновых кислот в исследуемой ткани свидетельствует положительное окрашивание метиловым зеленым — пиронином. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выявляют с помощью реакции Фёльгена, путем окрашивания метиловым зеленым по Курнику или исследуя УФ-спектры поглощения (265 нм) при контроле с кристаллической дезоксирибонуклеазой (ДНКазой).

О присутствии рибонуклеиновых кислот (РНК; свидетельствует окраска пиронином при рН 4,2 при контроле с рибонуклеазой. Поскольку рибонуклеаза не влияет на ба-зофилию, обусловленную наличием сильно полимеризо-ванной ДНК, проба с рибонуклеазой позволяет надежно различать ДНК и РНК.

Таблица 15

Схема гистохимического анализа белков (до Chayen u. Mitarb., с изменениями)

Основные белки Кислые белки Нейтральные белки Нуклеопротеиды

простые сложные простые сложные

Окрашивание прочным зеленым Ортохроматическое окрашивание

при кислом рН при нейтральном рН толуидиновым синим при р Н 4,1; окрашивание метиловым зеленым— пиронином

Аргинин (реакция Са-кагучи - положительная) Лизин (реакция Сакагу-чи - отрицательная; положительная с прочным зеленым при рН 8,0; отрицательная после дезаминирования) Не изменяется после обработки 5%-ной три-хлоруксус ной кислотой Метахромазия с толуиди-новым синим; кислые мукопротеи-ды (мукоид-ные вещества) Не изменяется после обработки 5%-ной три-хлоруксус-ной кислотой ШИК-реакция: гликопроте-иды Обработка 5%-ной трихлор-уксусной кислотой предотвращает окрашивание толуидиновым синим и метиловым зеленым-пиронином; остаточные белки окрашиваются прочным зеленым при рН 8,0

SH-группы (положительная проба по Шев-ремону (Chevremont) или Беннету (Bennet)

3. Гистохимическая диагностика веществ 61

Если обработка ДНКазой или РНКазой не предотвращает окрашивания основными красителями (базофилии), то речь, как правило, может идти о реагирующих метахро-матически сульфатированных и несульфатированных полисахаридах, обусловливающих метахроматическое окрашивание толуидиновым синим или метиленовым синим. Ионизированные фосфаты или полифосфаты выявляются с помощью пробы Эбеля. Несульфатированные кислые полисахариды, кроме того, дают положительную ШИК-реакцию (табл. 14).

3.1.3. УГЛЕВОДЫ

В гистохимии углеводов ШИК-реакция играет главную диагностическую роль. Положительная ШИК-реакция в сочетании с отсутствием окрашивания после бензоилиро-вания или ацетилирования может с большой долей вероятности рассматриваться как доказательство присутствия углеводов в исследуемом объекте. Проба с ацетилирова-нием одновременно помогает отдифференцировать ненасыщенные жирные кислоты, на которых эта процедура не действует. Надежным свидетельством присутствия гликогена служит окрашивание кармином по Бесту в сочетании с предварительной обработкой контрольных срезов диастазой или а- и Р-амилазой. Крахмал удается отдифференцировать от гликогена по реакции Люголя с иодом.

Для идентификации кислых мукоидных веществ используют следующие методы:

а) определение базофилии, б) выявление метахромазии, в) окрашивание альциановым синим и астрасиним, г) определение способности связывать коллоидную окись железа, д) ферментативное расщепление: гиалуроновой кислоты— гиалуронидазой, сиаломуцина — сиалидазой, нейрамино-вой кислоты—нейраминидазой.

Гликолипиды (цереброзиды или ганглиозиды) в отличие от прочих полисахаридов, будучи полисахарид-ли-пидными комплексами, дают положительную ШИК-реакцию и при этом окрашиваются Суданом черным В.

Ненасыщенные жирные кислоты в полисахарид-ли-пидных комплексах можно отдифференцировать от ШИК-

62 3. Гистохимическая диагностика веществ

положительных а-гликолей и а-аминоспиртов по пробе с бромированием и ацетилированием. В процессе ацетили-рования реакционноспособные гидроксильные группы и аминогруппы в отличие от ненасьгнденных жирных кислот блокируются и теряют свою способность окисляться йодной кислотой. Бромирование же, наоборот, ведет к блокированию двойных связей, тогда как гликоли продолжают оставаться доступными для окисляющего действия йодной кислоты (табл. 16).

3.1.4. ЛИПИДЫ

Для выявления липидов в клетках и тканях наиболее пригодны окрашивание Суданом черным В и флуоресцентный метод с бензгшреном. Материал, дающий положительную реакцию в любой из этих проб, содержит липиды. Для выделения фосфолипидов рекомендуется проба с кислым гематеином в сочетании ,с бромированием.

Положительная реакция до бромирования и отрицательная реакция после обработки свидетельствуют о присутствии фосфолипидов в исследуемой ткани. Связанные со структурами так называемые «маскированные липиды» выявляются после демаскирования обработкой в смеси метанол — хлороформ при помощи окраски кислым гематеином. Присутствие гликолипидов в исследуемой ткани устанавливается по следующим критериям (табл. 16): положительная ШИК-реакция, окрашивание Суданом черным В, отрицательная реакция с масляным красным и кислым гематеином даже после демаскирования. Свободные жиры, например нейтральные триглицериды, окрашиваются масляным красным и дают с нильским синим красное окрашивание, чем четко отличаются от синего окрашивания кислых липидов. Родственные липидам стероиды не окрашиваются обычными жировыми красителями. Их идентифицируют по аутофлуоресценции, при помощи реакции Адамса (Adams) или при помощи метода Шульца (табл. 16).

Целый ряд гистохимически выявляемых веществ присутствует в клетках и тканях, как правило, в низкой концентрации и, кроме того, не имеют всеобщего распространения. К таким веществам принадлежат аутофлуоресцирую-

Таблица 16

Схема гистохимического выявления липидов

Триглицериды Гликолипиды Фосфолипиды Стероиды

несвязанные связанные Окраска Суданом черным В Флуоресценция с бензпиреном Аутофлуоресценция Метод с перхлорной кислотой и нафтохи-ноном (Adams) Метод Шульца

Окраска масляным красным Красное окрашивание с нильским синим сульфатом ШИК-ПОЛОЖИ- тельные Положительная реакция с кислым гематеином Положительная реакция с кислым гематеином после демаскирования Отрицательная реакция с кислым гематеином Синее окрашивание нильским синим Слабое окрашивание масляным красным

Частично блокируется бромиро-ванием Блокируется бромированием

64 3. Гистохимическая диагностика веществ

щие вещества (например, каротиноиды, порфирины, птеридины), восстанавливающие вещества (например, аскорбиновая кислота, полифенолы) и пигменты. Динамические компоненты можно выявлять лишь с помощью радиоавтографии.

4. ГИСТОХИМИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ ВЕЩЕСТВ И ФЕРМЕНТОВ

4.1. БЕЛКИ

Гистохимическое выявление белков осуществляется двумя способами:

1) по их общим физико-химическим и биологическим свойствам,

2) по специфическим химическим группам и аминокислотам.

4.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

К этой группе методов относятся:

а) Иммунохимичсские методы

Специфические белки при использовании специфических реакций антиген — антитело выявляются под микроскопом с помощью реакций с антителами, меченными флуоресцеином.

*

б) Радиоавтографические методы

В этом методе метаболически активные белки выявляются по излучению после введения меченных тритием аминокислот.

в) Методы окрашивания, направленные на выявление кислотно-щелочных свойств

Подходящим методом является оценка изоэлектрической точки с помощью экстинкции метиленового синего. Лишь

3-235

66 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

при соблюдении стандартных условий можно говорить об идентичности или различии двух веществ. При определении базофилии следует обращать внимание на то, что помимо белков базофилией обладают также нуклеиновые кислоты и некоторые полисахариды. Для того чтобы исключить воздействие фиксации на белки, желательно использовать свежие криостатные срезы.

г) Методы, основанные на различиях в растворимости

Эти методы основаны главным образом на экстрагировании белков солевыми растворами различной ионной силы и рН. Для этих целей используют криостатные срезы, а также срезы лиофилизированного материала или ткани, подвергнутой замещению в замороженном состоянии. Срезы, предварительно обработанные растворителями (водой, 1%-ным раствором NaCl, буферными растворами или растворами сульфата аммония или аммиака), подвергают специальному окрашиванию на белок (реакция Мил-лона или реакция с ДНФБ) одновременно с нефиксированными контрольными срезами. Различия между срезами указывают на присутствие белка, вымываемого определенным раствором.

д) Методы ферментативного расщепления

Эти методы основаны на том, что белки по-разному относятся к катаболическим ферментам. Действие фермента определяется по продуктам распада белка или путем микроскопического изучения обусловленных ферментативным действием изменений субстрата в гистологическом препарате. Именно этот второй подход и находит применение в гистохимических методах. Изменения субстрата, происходящие в препарате, оцениваются при помощи методов окрашивания, направленных на выявление ре-акционноспособных групп в молекулах белка, а также при помощи окрашивания забуференными растворами красителя. Помимо этого, используются также и гисто-физиче-ские методы (например, интерференционная или поляризационная микроскопия). Эти методы позволяют исследова-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 67

телю делать важные заключения, поскольку воздействие протеаз ведет к изменениям в макромолекулярной структуре белков.

4.12. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Гистохимическое выявление белков основано главным образом на наличии реакционноспособных групп в аминокислотах. При помощи гистохимических методов можно выявлять аминокислоты, включенные в ст