руктуру белка. Простые аминокислоты и низкомолекулярные белки вымываются из ткани в процессе фиксации и заливки. Как это будет видно из дальнейшего рассмотрения, в настоящее время существуют гистохимические методы для выявления лишь части аминокислот. Эти методы не обеспечивают информации ни об аминокислотном составе и аминокислотной последовательности, ни о величине и пространственном расположении белковой молекулы. Для идентификации белка эти методы применимы лишь в том случае, когда выявляемые реакционноспособные группы присутствуют в высоких концентрациях и могут служить характерным признаком данного специфического белка. Так, для кератиноподобных структур характерны высокие концентрации дисульфидных групп. Для общего изучения белка можно рекомендовать методы выявления концевых амино- и карбоксильных групп.

При помощи реакций окрашивания можно выявлять следующие реакционноспособные группы и аминокислоты в белках:

а) аминогруппы концевых а-аминокислот (— СН2 — -CHNH2 СООН),

б) концевые или боковые карбоксильные группы (СООН),

в) сульфгидрильные группы цистеина (— SH),

г) дисульфидные группы цистина (— S — S),

д) индольную конфигурацию триптофана,

и) л-замещенную фенольную конфигурацию тирозина, ж) гуанидильные группы аргинина,

е) имидазольные группы гистидина.

3*

68 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов '

4.1.2,1. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА

Надежным методом выявления общего белка является метод с динитрофторбензолом (ДНФБ-реакция). 2,4-ДНФБ реагирует количественно со свободными аминогруппами, с е-аминогруппами лизина, с фенольными ОН-группами тирозина и с имидазольными группами гистидина. В то время как образующиеся с тирозином и гистиди-ном комплексы бесцветны, со свободными аминогруппами эта реакция ведет к образованию окрашенных (желтоватых) производных динитрофенола. Визуализация более или менее бесцветных комплексов ДНФБ с белком (рго-tein-P) осуществляется при помощи реакции восстановления по Даниелли (Danielli) в щелочном растворе этанола. В результате последующего диазотирования комплекса, в реакции сочетания с нафтолом или нафтол-серной кислотой образуется окрашенный комплекс азокрасителя.

ног N0, ,

белм'ННг + Г —{^У~NOi -e^wer-NH—N0» + Н + F" —j

Миазо- „ /—к тировшше /—V •Af^-NH-те

сб

Nci.S.Oa

ОН

«Нафтол »^^,NH_^~^NgN._^^0H

Окрашенный комплекс азокрасителя

ДНФБ-реакция может также использоваться для выявления отдельных реакционноспособных групп. Для этого, необходимо прежде блокировать остальные группы. Блокирование тирозина и гистидина осуществляется при помощи соли диазония (например, стабилизированный 5-ни-троанизидин), что делает возможным проведение реакции ДНФБ только с аминогруппами. SH-группы можно исключить при помощи окисления иодом. Если же необходит

4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 69

мо провести реакцию с тирозином, то в этом случае блокируют NH2-rpynnbi азотной кислотой, a SH-группы—окислением иодом.

Помимо ДНФБ-реакции в качестве надежных групповых реакций для морфологического анализа белков (табл. 17) можно использовать реакцию с тетразонием по Даниелли (Danielli, 1947), Пирсу (Pearse, 1960) и Лизону (Li-son, 1960), а также реакцию с нитробензоилхлоридом по Берстону (Burstone, 1955). Сравнение этих трех методов показывает, что здесь имеются заметные различия в отношении выявляемых реакционноспособных групп аминокислот, которые могут иметь значение при направленном исследовании.

Таблица 17

Методы о;шовременного выявления различных реакционноспособных груш и аминокислот (Gossner)

Реакция

j _ Реакционноспособные группы илн аминокислоты

|ТИ1

Тетразониевая реакция | + (Danielli, Pearse) ,

Реакция с дииитрофтор- + бензолом (Danielli, Bur-J stone) I

Реакция с нитробензоил-. + хлоридом (Burstone) '

трип- ГИСТН- ЛНЗНН (аргинин ОКСИ- 1

тофан дин цролин'

+ 1 +

+ +

+ 1 + + |

J__L

аминогруппы

сульф-

-ИДриЛЬ'

ные группы

Флуоресцентно-микроскопическое выявление общих белков осуществляется с помощью сульфафлавина по Ле-манну и Руху (Leemann, Ruch, 1972). Результаты реакции поддаются количественной оценке при помощи флуоресцентной цитофотометрии.

4.1.2.2. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ РЕАКЦИОННО-СПОСОБНЫХ ГРУПП И АМИНОКИСЛОТ

а) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ АМИНОГРУПП

Аминогруппы концевых аминокислот в результате окислительного дезаминирования превращаются в альде-

70 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

гиды, которые в свою очередь выявляются при помощи pel актива Шиффа. По этому же механизму протекает сравни тельно просто проводимое окислительное выявление а-аминокислот при помощи нингидрина, аллоксана, гипа хлорита натрия и хлорамина Т. В основе этих методов ле^ жит принцип окислительного дезаминирования; механизм этой реакции можно разбить на несколько промежуточны! этапов.

с-с-он+^Д ^^ои.МА + н,о

NH2 С ОН NH *jj Н

О О

0 О R-C-C-0H + Н20 —*• R-C-H + С02 + NH3 NH

i

К наиболее надежным методам выявления а-аминокио лот принадлежит метод с О-диацетилбензолом. Исследо| вателю приходится, однако, самому проводить синтез pes актива, поскольку последний не выпускается промышлен-н остью.

В качестве чувствительного флуоресцентного методу для выявления NH2-rpynn следует упомянуть метод со цЩ лочным раствором салицилового альдегида по Стовардз (Stoward, 1963).

б) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКАМИ К АРБОЙ СИЛЬНЫХ ГРУПП

В основе разработанного Барнетом и Зелигманоа (Barrnett, Seligman, 1958) гистохимического метода выявле! ния связанных с белками ациламидо-карбоксильных rpynj лежит следующий механизм. В результате обработки ук| сусным ангидридом в пиридине связанные с белками о| ациламидо-карбоксильные группы переводятся в соотвев ствующие кетоны, которые в свою очередь реагирую*) с реагентом на карбонильную группу—гидразидом 2-оЩ си-3-нафтойной кислоты. Гидразид в свою очередь ста?

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 71

ловится видимым в результате реакции сочетания с прочным синим В.

R CONH СН2СООН + СН3СО О ОС СН3 Пиридин,

ot-Ациламидокарбоксил Уксусный ангидрид

RCONH СН2СОСН3 + СН3СООН + С02

Карбонильное производное

Однако, согласно исследованиям на модельных веществах с уксусным ангидридом реагируют в первую очередь карбоксильные группы боковых цепей. Предполагается, что в результате обработки уксусным ангидридом в пиридине на боковых цепях образуются смешанные ангидриды с карбоксильными группами (I). На последующем этапе смешанные ангидриды реагируют с гидразидом 2-окси-З-нафтойной кислоты. При этом образуется дигид-разид (II), который становится видимым благодаря реакции сочетания с прочным синим В.

I R(CH2)„COOH + CH3 СО ООССНз^=5

Карбоксильная группа Уксусный ангидрид . боковой цепи

R (СН2)„ СО О ОС СН3 + СН3 СООН

Смешанный ангидрид

II R (СН2)„ СО О ОС СН3 + H2N.HNOC

Смешанный ангидрид НО

Гидразид 2-окси-З-нафтойной кислоты

R(CH2),CO.HN.HN-OC /у\ +CH^COOH

Для практического использования реакции выявления карбоксильных групп по Барнету и Зелигману имеет значение, что смешанные ангидриды разрушаются в результате обработки 0,1 н. NaOH в течение 15 мин при + 22°С, тогда как примеси метилкетонов, образующиеся из концевых

72 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

карбоксильных групп, остаются без изменений. В результате этого можно провести дифференцировку между боковыми и концевыми карбоксильными группами.

в) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ТИРОЗИНА

Для выявления фенолов (тирозина) пригодна реакция Миллона, а также реакция диазосочетания. Благодаря простоте и малым затратам реактивов для повседневного использования рекомендуется реакция Миллона. Она основана на способности фенола к образованию окрашенных комплексных соединений с солью ртути и азотной кислотой. Из модификаций реакции Миллона интенсивным окрашиванием продукта реакции выделяется модификация Бейкера, в которой в результате обработки тирозина хлоридом ртути в присутствии нитрита калия образуется интенсивно окрашенный продукт реакции.

кислоты

Тирозин 2-Иитрозотироэин Диазтпирозин

Тирозин-в - изо- 1-нартол - 5-сцлыроновая кислота /окрашенный продукт реакцию

Помимо реакции Миллона, надежные результаты могут быть получены при помощи реакции диазосочетания по Гленнеру и Лилли (Glenner, Lillie, 1957), которая представляет собой гистохимическую модификацию реакции Мореля—Сисли. Эта специфичная для тирозина реакция имеет следующие преимущества перед реакцией Миллона: она дает более интенсивное окрашивание и позволяет установить более точную локализацию продукта реакции.

В основе метода лежит следующий принцип: в результате диазотирования тирозина образуются вначале нитро-зотирозин, а в результате длительной обработки холодной

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 73

азотной кислотой—диазотирозин. Путем сочетания с S-кислотой(8-амино-1-нафтол-5-сульфоноваякислота)диазо-тированный тирозин переводится в имеющий интенсивную красную окраску азокраситель. Помимо упомянутой S-кислоты для реакции сочетания вполне пригодна 1-ами-но-8-нафтол-4-сульфоновая кислота. Правда, эту S-кисло-ту трудно синтезировать.

г) ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ГИСТИДИНА

Гистохимическое выявление гистидина проводится на основе метода, разработанного Лзндингом и Холлом (Landing, Hall, 1956). Правда, слабым местом в этой реакции является этап блокирования тирозина и гистидина с помощью иодирования, проводимого исходя из требований специфичности реакции. Бахмаин и Зайтц (Bachmann, Seitz, 1961) модифицировали в методе Лэндинга—Холла процедуру иодирования и состав среды, в которой проводится реакция сочетания, а также процесс восстановления метабисульфатом калия. Эта модифицированная процедура позволяет проводить гистохимическое выявление гистидина с достаточной специфичностью.

д) МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТРИПТОФАНА

Гистохимические методы выявления триптофана основаны на образовании окрашенного продукта конденсации с альдегидами. Помимо триптофан