-ном этаноле и 8 капель 1%-ного раствора гипохлорита натрия; раствор необходимо готовить непосредственно перед употреблением). Реакция окрашивания развивается в реакционной смеси постепенно. ,¦

6. Реактив слить с предметного стекла, препараты осторожно просушить фильтровальной бумагой н поместить на 3 мин в смесь высушенного пиридина и безводного хлороформа.

7. Препараты заключить под покровное стекло в смесь пиридин — хлороформ или в безводный пиридин. Поскольку сохранность таких срезов непродолжительна, рекомендуется просматривать их сразу.

РЕЗУЛЬТАТ -

Белки, содержащие аргинин, окрашиваются в различные оттенки оранжевого.

ПРИМЕЧАНИЯ

Модификации реакции Сакагучи для гистохимического выявления аргинина всегда связаны с определенными недостатками. Их можно суммировать следующим образом:

а) малая стабильность окраски, б) для проявления окрашивания требуется гипохлорит, который, однако, мешает реакции образования красителя; в) щелочная реакционная среда разрушающе действует на ткань; г) точная л окал из а-

90 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ция реакции затруднена возможной диффузией продукта.

Среди используемых вместо а-нафтола его производных наиболее интенсивную окраску дает 2,4-ди-хлор-1-нафтол; эта окраска в щелочной среде достаточно стабильна для фотометрических измерений.

ДИОКШДИНАФТИЛДИСУЛЬФИД(ДДД)-РЕ АКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКОМ СУЛЬФГИДРИЛ ЬНЫХ ГРУПП ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМАНУ (BARRNETT, SELIGMAN, 1952, 1953)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: смесь трихлоруксусной кислоты с этанолом (1%-ная трихлоруксусная кислота в 80%-ном этаноле), 24 ч, Карнуа, формалин.

2. Быстрая заливка в парафин (вакуумный сушильный шкаф); парафиновые срезы прикрепляют небольшим количеством смеси белок—глицерин на предметное стекло.

3. Срезы депарафинировать и через серию спиртов понижающейся концентрации довести до дистиллированной воды.

Варианты: срезы, депарафинированные^в ксилоле, промыть в абсолютном этаноле и покрыть 0,5%-ным целлоидином (0,5 г целлоидина растворить в 100 мл абсолютного этанола и эфира 1:1). Тонкую пленку целлоидина на срезах просушить, уплотнить в 70%-ном этаноле, перенести срезы в дистиллированную воду.

4. Срезы обработать (в кювете) при +50° С ДДД-реа-гентом (50 мг 2,2-диокси-6,6-динафтилдисульфида; 30 мл абсолютного этанола; 70 мл натрий-вероналового буфера, рН 8,5), 1 ч.

5. Кювету со срезами охладить при комнатной температуре, 10 мин.

6. Быстро промыть срезы в дистиллированной воде.

7. Промыть в дважды сменяемой дистиллированной воде, подкисленной до рН 4—4,5 уксусной кислотой, 10 мин.

8. После проведения через ряд спиртов возрастающей концентрации промыть срезы в двух сменах абсолютного эфира. 5 мин.

9. Довести через ряд спиртов до дистиллированной воды и сполоснуть в ней.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 91

10. Срезы при комнатной температуре поместить в свежеприготовленный 0,1%-ный раствор тетразотированного диортоанизидина (соль прочного синего В) на 0,1 М фосфатном буфере Сёренсена, рН 7,4, 2 мин.

11. Промыть в проточной воде и затем в дистиллированной.

12. Монтировать в глицерин-желатине или провести через серию спиртов возрастающей концентрации и ксилол и заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры с большим количеством активных SH-групп окрашиваются в синий цвет, при меньшем количестве более рассеянных SH-групп возникает красное окрашивание.

ПРИМЕЧАНИЯ

Для прохождения реакции имеет значение концентрация используемой соли диазония. Более высокие концентрации ведут к получению непостоянных результатов. Вместо прочного синего В можно использовать следующие соли диазония: прочный красный RC, прочный синий RR, прочный черный К. ДДД-реакция допускает проведение микроспектрофотометрической количественной оценки содержания SH-групп в срезах тканей. ДДД-реагент можно также использовать для химического определения SH-групп в белках.

МЕТОД ОКИСЛЕНИЯ НАДМУРАВЬИНОЙ КИСЛОТОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ S-S- И SH- ГРУПП ПО ПИРСУ (PEARSE, 1951)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: кальций-формол, формалин, Ценкер и др., заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды.

3. Обработать раствором надмуравьиной кислоты, 10—30 мин (к 40 мл 98%-ной муравьиной кислоты доба-

92 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

вить 4 мл 30%-ной свежей перекиси водорода (Н202) и 0,5 мл концентрированной H2S04; смесь готовить за час до использования и применять не более 24 ч).

4. Срезы промыть в дистиллированной воде, 2—5 мин.

5. Поместить в реактив Шиффа, 30—60 мин. (Особенно

пригодны реактивы Шиффа, приготовленные по De Toma-si, Itikawa.)

6. Промыть в проточной слегка теплой воде, 10 мин.

7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие цистин, в зависимости от его количества окрашиваются в цвета от розового до темно-красного. Особенно интенсивно окрашивается кератинсо-держащие структуры. Четкую реакцию дают нейромедиа-торы, содержащие S —S-группы, а также базофильные клетки передней доли гипофиза.

4.2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотида, образованные из многочисленных мононуклео-тидов. Каждый мононуклеотид состоит из пентозы (дез-оксирибозы или рибозы), ортофосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового основания. Пентоза связана дизфирной связью с фосфорной кислотой и гликозидной связью—с основанием. Нуклеиновые кислоты объединяются с основными белками (гистонами) в нуклеопро-теиды. В животных и растительных тканях встречаются два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК, пентоза представлена дезоксирибозой) и рибонуклеиновая кислота (РНК, пентоза представлена рибозой). ДНК содержит пуриновые основания—аденин и гуанин—и пиримидиновые основания—тимин и цито-зин. В РНК тимин замещен урацил ом. Согласно модели Уотсона—Крика, молекула ДНК состоит из двух нера-зветвленных полинуклеотидных цепей, закрученных в одну двойную спираль вокруг общей оси, Пуриновое основание одной цепи связано водородным мостиком с пиримиди-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 93

новым основанием другой. При этом возникают две возможности спаривания оснований—аденина с тимином и гуанина с цитозином. Подобное строение молекулы ДНК играет роль как в объяснении генетической репликации молекулы ДНК, так и в гистохимическом ее выявлении.

Согласно современным представлениям, РНК в отличие от ДНК всегда существует в виде одиночной цепи.

Как правило, ДНК находится в клеточном ядре—в хромосомах и в меньшей мере в митохондриях и пластидах. РНК же встречается в цитоплазме, в ядрышках, в хромосомах и в митохондриях. В цитоплазме РНК находится главным образом в микросомной фракции (гранулы Пала-да, связанные, с эндоплазматическим ретшсулумом).

При гистохимическом выявлении нуклеиновых кислот используются следующие принципы (табл. 21):

1. Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований по УФ-поглощению.

2. Выявление углеводного компонента.

3. Выявление фосфорной кислоты.

4. Выявление базофилии.

5. Выявление с помощью методов специфической ферментативной и химической экстракции.

4.2.Г. ВЫЯВЛЕНИЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ ПО УФ-ПОГЛОЩЕНИЮ

Разработанные Касперссоном методы поглощения ультрафиолетовых лучей для количественного и качественного выявления ДНК и РНК основаны на свойстве гетероциклических колец пуриновых и пиримидиновых оснований поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны 260 нм. Этот трудоемкий и технически сложный метод дал сильный толчок исследованиям нуклеиновых кислот. Правда, с его помощью нельзя проводить прямое дифференциальное выявление ДНК и РНК.

Гистохимические методы выявления нуклеиновых кислот

Таблица 21

Результат реакции окрашивания ДНК РНК

+ +

+ + (Черное) —

Голубовато-пурпурное + Красно-оранжевое

+ + + +

Зеленое Красное

+ + (10%-ная хлорная кислота, 18 ч, при +4° С +

- —

Основа

Метод

Примечания

Пуриновые и пиримидиновые основания

Пентоза

Фосфорная кислота

Ферментативная и химическая экстракция

УФ-поглощенне при 2600 А

Реакция Фёльгена

Реакция Фёльгена - серебро-метенамин (Korson, 1964)

Метод Турчини (Bladder, Alexander, 1952)

Флуорохромирование с помощью бис(4-аминофе-нил)-1,3,4-оксадиазола -БАО (Ruch, 1970)

Определение базофилии

Окрашивание галлоциани-ном и хромовыми квасцами (de Boer, Sarnaker, 1956)

Метиленовый зеленый-пи-ронин (Kurnick, 1955)

Рибонуклеаза

Дезоксирибонуклеаза

Экстракция хлорной кислотой

Экстракция трихлоруксусной кислотой

Экстоакиия соляной кисло-

Доступно количественной оценке То же

Надежные методы с достаточной специфичностью

10%-ная хлорная кислота за 20-30 мин при +70° С экстрагирует все нуклеиновые кислоты

5-10%-ная трихлоруксус-ная кислота удаляет при +90° С за 10 мин все нуклеиновые кислоты

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 95

4.2.2. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО КОМПОНЕНТА

1. РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕНА

Этот классический метод выявления ДНК основан на том, что в результате мягкого гидролиза под влиянием 1 н. НС1 в фиксированных препаратах происходит отщепление пуриновых оснований, связанных с Q-атомом дезоксирибозы.

Ci-C4-C9-Ci-Ci-lly

°\

НО-Р=0

Св-с*-с3-с2-с,-пи о

НОНР^О

С5-С4- Сз-С2-С,-Пу +1,0н.НС1; + 60вС

Ce-CrCj-Ci-C,^

о

НО-Р=0

\

Св-С^-Сз-Сг-^-Пи

о

НО-Р=0

ce-c4-Cj-c2-qf

Образующиеся при этом реакционноспособные альдегидные группы дают с реактивом Шиффа кислотостойкий краситель — от красного до красно-фиолетового цвета. Для гистохимического выявления ДНК имеет значение тот факт, что при точном соблюдении условий гидролиза фосфатные мостики дезоксирибозы не

96... 4t Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

разрушаются; все соединение не теряет кислотного характера и сохраняет нерастворимость. Образования альдегидов из рибозы РНК в результате кислотного гидролиза не происходит, поскольку при этой процедуре РНК практически полностью вымывается из среза. Поэтому при