Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

правильном проведении реакции Фёльгена РНК всегда остается неокрашенной. Свободные альдегидные группы (плазмали) выявляются в контрольных опытах при обработке реактивом Шиффа и без солянокислого гидролиза; это позволяет отдифференцировать их от альдегидных групп пентозы, высвобождающихся в результате гидролиза. Правда, так называемая «плазмалевая реакция» ветре' чается, как правило, лишь в замороженных срезах.

Результаты реакции Фёльгена зависят от используемой фиксирующей смеси и от продолжительности гидролиза. Слишком продолжительный гидролиз ведет к расщеплению эфирной фосфатной связи между С3 и С5 н, следовательно, к образованию растворимого нуклеотида. Ниже указано оптимальное время гидролиза для разных фиксирующих смесей:

2. ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ БАО (RUCH, 1970)

В этой модифицированной реакции Фёльгена вместо парарозанилина используется флуорохром БАО [бис-(4-аминофенил)-1)3,4-оксадиазол]. Гидролиз можно проводить при различных температурах и разных концентрациях НС1. Для количественных исследований и для дости? жения высокого контраста между клеточным ядром н цитоплазмой наиболее пригоден гидролиз с помощью 1 н. НС1 при +60° С. Можно вместо БАО для флуорохроми-рования взять аурамин О в концентрации 0,2%.

Нейтральный формалин

Карнуа *

80%-ный этанол

Формалин — этанол — уксусная кислота Смесь с пикриновой кислотой

8 мин 8 мин 5 мин 7 мин 22 мин

по Буэну-Аллену Ценкер ..

Ньюкомер (растительная ткань) Ньюкомер (животная ткань)

5 мин 10 мин 20 мин

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 97

3. РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕН-СЕРЕБРО-МЕТЕНАМИН (KORSON, 1964)

После гидролиза в 1 М лимонной кислоте в срезах развивается четкое черное окрашивание ДНК при обработке в растворах метенамин — серебро. Сходные результаты достигаются и при обычном солянокислом гидролизе при + 60°С.

4. МЕТОД ТУРЧИНИ (BLACKLER, ALEXANDER, 1952)

В этом методе за мягким гидродизом с помощью 1 н. НС1 следует реакция с метилтриоксифлуореноном. При этом углеводные компоненты нуклеиновых кислот, реагируя с флуоренонами, образуют окрашенные соединения (ДНК—фиолетовое; РНК—желто-розовое).

4.2.3. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ

Фосфатные группы нуклеиновых кислот можно выявлять с помощью таких гистохимических методов, как окрашивание основными красителями, микроозоление и радиоавтография. Наибольшее применение в практике нашел метод окрашивания основными красителями.

1. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ПОМОЩИ КИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА

Методы выявления фосфатных групп ДНК основаны на кислотном гидролизе в присутствии молибдата аммония. Осадок фосфомолибдата аммония на втором этапе реакции восстанавливается бензидином до молибденовой сини (например, Serra, Queiroz Lopes, 1945). Диффузное синее окрашивание, развивающееся в результате реакции, не позволяет установить четкой локализации.

2. ВЫЯВЛЕНИЕ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ ОСНОВНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

Основные красители дают с отрицательно заряженными фосфатными группами более или менее избирательное

4-235

98 4.. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

окрашивание. Поскольку ни один из методов окрашивания нуклеиновых кислот не является абсолютно специфичным, необходимо проводить контрольные реакции, чтобы выяснить, действительно ли выявляемые кислотные группы принадлежат нуклеиновым кислотам.

а) ОКРАШИВАНИЕ ТИАЗИНОВЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

Из группы этих красителей можно рекомендовать ме-тиленовый синий:

Этот легкоокисляемый краситель может содержать примеси азуров или метилового фиолетового. Окрашивание забуференным раствором метиленового синего дает надежные результаты. Следует обращать внимание на то, что при значениях рН от 3 до 5 окрашиваются не только нуклеиновые кислоты, но и кислые мукополисахариды. Их удается отдифференцировать с помопдью контрольных? опытов с нуклеазами.

Для выявления нуклеиновых кислот помимо метиленового синего можно использовать и толуидиновьш синий, который при рН 4,0—6,0 связывается с РНК в стехиоме-; трических соотношениях. Различное окрашивание обеих* нуклеиновых кислот можно получить при помощи метода Федера и Вольфа (Feder, Wolf) с использованием акролеина и толуидинового синего (ДНК—темно-синий цвет; РНК—нежно-красный). Крезиловый фиолетовый реагирует с РНК стехиометрически (при рН 4,2) и поэтому может быть использован для цитофотометрического количественного определения РНК.

б) ОКРАШИВАНИЕ КОМПЛЕКСОМ ГАЛЛОЦИАНИН - ХРОМОВЫЙ КВАСЦЫ

В результате этого простого окрашивания обе нуклеиновые кислоты приобретают темно-синий цвет. Специфич-i ность окрашивания зависит от рН раствора красителя! При значениях рН от 1,5 до 1,7 специфичность по отношЫ

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 99

нию к нуклеиновым кислотам довольно высока. Принадлежащий к оксазиновым красителям галлоцианин в водных растворах существует в виде катиона. Образование комплекса галлоцианина с хромовыми квасцами ведет к появлению новых красящих свойств. За связывание комплекса галлоцианин — хромовые квасцы с нуклеиновыми кислотами ответствен главным образом хром.

Ниже приводится структура комплекса (Harms) и механизм его связывания с ДНК (Sandritter):

(CHj)2N

соон

+ t

S04"

(CH,)2N

соон

Дезоксирибоза

онг /\

Ср Дезоксирибоза О I^OHj

Предполагается, что при взаимодействии катионов красителя с нуклеиновыми кислотами каждая фосфатная группа нуклеиновой кислоты связывается с одной молекулой красителя.

Поскольку краситель соединяется с субстратом в сте-хиометрических соотношениях, этот метод может быть использован для количественного цитофотометрического определения. Для такого определения имеет также значение то, что комплекс галлоцианин — хромовые квасцы связывается с нуклеиновыми кислотами весьма прочно.

в) ОКРАШИВАНИЕ МЕТИЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ - ПИРОНИНОМ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК

Окрашивание метиловым зеленым — пиронином было

4*

106 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

введено в практику в качестве эмпирического метода еще Паппенгеймом (Pappenheim). Более тщательные исследования, особенно в сочетании с расщеплением рибонуклеазой для установления специфичности окрашивания РНК пиронином, показали, что при помощи этого метода на одном срезе одновременно выявляются и ДНК, и РНК. Интерпретация дифференциального выявления ДНК и РНК с помощью метилового зеленого и пиронина, из которых оба являются катионными красителями, долгое время наталкивалась на трудности. Предполагается, что в данном методе поведение красителя объясняется не электростатическими взаимоотношениями красителя с нуклеиновыми кислотами, а различной степенью полимеризации обеих нуклеиновых кислот. Значительно большие по размерам молекулы ДНК всегда связываются с метиловым зеленым, тогда как менее полимеризованные молекулы РНК захватывают пиронин. Определенным свидетельством в пользу такого предположения может служить тот факт, что после деполимеризации ДНК окрашивается пиронином.

Интенсивность окрашивания метиловым зеленым в контролируемых условиях можно оценивать количественно с помощью цитофотометрии. Полученные при этом результаты следует, однако, сравнивать с результатами других методов, таких, как реакция Фёльгена или биохимическое определение. Взаимодействие пиронина с РНК протекает, по-видимому, нестехиометрично. Поэтому пиронин малопригоден для количественного анализа.

*N«CHSJS

2СГ

Структурная дюрмула метилового зеленого

н

Структурная дхрмула пиронина Y (6J

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 101

4.2.4. ВЫЯВЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ХИМИЧЕСКОЙ ЭКСТРАКЦИИ

Удалять нуклеиновые кислоты из гистологических срезов можно двумя способами:

1) путем воздействия ферментом; 2) путем химической экстракции.

Хотя оба способа имеют определенные недостатки, предпочтение все же следует отдать ферментативным методам. Из факторов, влияющих на действие фермента (концентрация фермента в растворе, температура, рН и др.), в первую очередь следует учитывать влияние фиксации на ткань.

4.2.5. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

4

Методы электронно-микроскопического выявления нуклеиновых кислот лишь начинают разрабатываться. Имеющиеся в распоряжении исследователя методы по-.зволяют проводить ультраструктурное выявление ДНК и РНК главным образом с помощью различных приемов контрастирования: все они, однако, сопряжены со значительной неопределенностью получаемых результатов. Хорошее контрастирование ДНК и РНК достигается с помощью растворов уранилацетата и солей свинца. Можно повысить специфичность контрастирования по отношению к нуклеиновым кислотам путем исключения белков. Применяемые методы приведены в табл. 22.

4.2.6. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

СТАНДАРТНАЯ РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕНА

МЕТОДИКА

1. Фиксация одним из перечисленных выше (стр. 96) фиксирующих веществ, заливка в парафин.

Таблица 22

Методы ультрагнстохимяческого выявления нуклеиновых кислот (но Geyer, с изменениями)

Нуклеиновые кислоты

Метод

Авторы

Примечания

ДНК

ДНК и РНК

РНК

ДНК или РНК

ДНК или РНК

Тиокарбазид-протеинат серебра

Акрифлавин - фосфоволь-фрамовая кислота (Акр-ФВК)

А) Контрастирование спиртовым раствором Акр-ФВК

Б) Контрастирование водным раствором Акр-ФВК

Регрессивное контрастирование уранилацетатом

Chan-Curtis., Belt, La-doulis (1970)

Bernhard (1969)

Расщепление нуклеиновых кислот в толстых срезах

Расщепление нуклеиновых кислот в гликольмета-крилатных ультратонких срезах

Swift (1962, 1964)

Leduc, Marinozzi, Bernhard (1961, 1963)

Требуются контроля специфичности, например блокирование альдегидных групп, расщепление ДНК

Контрастирование хроматина, ядрышек и рибосом; кроме того, раствор Б контрастирует миели-новую оболочку

Близкое к избирательному контрастирование рибонуклеопро-теидов; специфичность контрастирования РНК следует проверить в контрольных опытах с химическим или ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот

Для каждого исследуемого объекта необходимо предварительно подобрать оптима

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)