Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

бных групп может быть обратимым.

неон I

неон I

+ (CHS COfe о

Пиридин

1,2-гмеком Якусньм ангидрид

. т4*

нс-о-с=о I

нс-о-с=о I I

СНз

1,2-ацетилэашр

ИС-0-С=0

нс-о-с=о ) I

CHj

+ г кон

I

неон

неон

I

гсмзсоок

Омыление

43.2,3. ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ

Для гистохимического выявления кислых мукоидных веществ и дифференцировки их от ШИК-положительных нейтральных используют следующие приемы.

1. Определение метахромазии.

2. Реакцию связывания коллоидных металлов.

3. Окрашивание альциановым синим.

4. Окрашивание астрасиним.

5. Выявление базофилии.

6. Методы блокирования кислых групп.

7. Экстрагирование гиалуронидазой.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАХРОМАЗИИ

Метахромазия выражается в изменении спектров поглощения используемых красителей в гистохимических условиях при окрашивании определенных элементов тканей и клеток. При окраске толуидиновым синим наблюдается метахромазия от красно-фиолетового до красного. Под метахромотропностью понимают способность компонентов ткани вызывать метахроматическое смещение. Термин «сила метахромотропности» (Graumann, 1959, 1961) помо-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 117

гает охарактеризовать различия между отдельными кислыми мукоидными веществами.

Метахромазия определяется по двум критериям (Pearse, 1968):

а) смещение максимума поглощения красителя в сторону более коротких волн (табл. 25);

б) уменьшение молярного коэффициента экстинкции в области максимума поглощения.

Таблица 25

Спектры поглощения красителей, дающих метахро-мазию (Pearse, 1968)

Краситель Максимум поглощения, нм ортохроматический метахроматический

Толуидиновый си- 630 480-540

ний

Азур А 620 480-530

Метиленовый си- 665 570

ний

Крезиловый синий 625 530

Кристаллический 590 510

фиолетовый

Основной фуксин 543 510

Тионин 597 557

Как видно из табл. 25, использование какого-либо красителя для определения метахромазии основано на том, что ортохроматический и метахроматический максимумы поглощения находятся, насколько это возможно, далеко друг от друга.

Метахроматически реагирующие вещества обладают, как правило, высоким молекулярным весом и свободными анионными группами. Сюда относятся прежде всего диссоциирующие кислые группы. Проявление метахромазии определяется плотностью анионов на поверхности молекулы субстрата, а также степенью ионизации. Если расстояние между заряженными группами составляет, например, 10 А, то никакой метахромазии не наблюдается (табл. 26).

118 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

Таблица 26

Связь между метахромазией и плотностью заряда на поверхности субстрата

Субстрат Анионные группы Рассто5шие между анионными группами, А Реакция с Mei ахроматическим красителем

Разведенный водный раствор гиалуроновой кислоты Полимер-пектинат с линейной цепью Глюкуроноамино- гликаны П олисахаридные единицы в кислых мукополисаха-ридах сосг 10,3 Отсутствие метахро-мазии

соо- OSOj- и СОСГ-группы пооче: ре дно Замещение от двух до трех ОН-групп oso-- группами Около 5 4-6 Менее 4 Слабая метахромазия Умеренная стабильная метахромазия Сильная стабильная метахромазия

Сила анионных групп снижается в следующем ряду: ROSOJ - R О НРО3 - RCOO-

Развитие метахромазии может проходить по двум этапам. Первый этап характеризуется возникновением полярных связей между анионами субстрата и основными группами красителя:

Полисахарид

Краситель

На втором этапе в присутствии воды происходит связывание соседних молекул красителя с теми молекулами красителя, которые уже были ранее связаны с субстра-

_4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 119

том благодаря вандерваальсовьгм силам:

Полисахарид

.XZ^LJC^UCJL

?4Ж ЙЙГ

Краситель х-Вода

По-видимому, после реакции красителя с анионами выявляемого мукополисахарида происходит укладка молекул красителя в упорядоченную структуру и возникает при этом межмолекулярное взаимодействие. В результате появляется характерный для метахромазии новый спектр поглощения. Поскольку метахромазия, согласно Сильвену (Sylven), может рассматриваться как особый тип упорядоченной агрегации молекул красителя, то она характеризуется образованием новых межмолекулярных связей между соседними молекулами красителя. Все факторы, способствующие сохранению обычной молекулярной ориентации, препятствуют метахромазии.

Проводимое Сильвеном разделение на резистентную к спирту «истинную метахромазию» (называемую также у-метахромазией—от красного к розовому) и лабильную в отношении спирта «ложную метахромазию» (Р-метахро-мазия—фиолетовое окрашивание) основано на присутствии в первом случае эфиров серной кислоты, устойчивых к спирту. Лабильная метахромазия, например, обусловлена веществами, не имеющими сульфатных групп.

Изменение окраски толуидинового синего или тионина на «зеленоватую» (так называемая «отрицательная метахромазия»), наблюдаемое в случае нуклеиновых кислот в зависимости от концентрации, не нашло еще теоретического обоснования.

Полисахариды, которые обычно не дают метахромазии, после введения отрицательно заряженных радикалов при помощи различных воздействий (продолжительное окисление хромовой кислотой или перманганатом, суль-фатирование, фосфатирование) могут проявить метахро-матическую реакцию. И наконец, метахроматический эф-

120 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

фект способны давать также метафосфаты, нуклеиновые кислоты и полипептиды.

Что касается практики, то для выявления метахрома-зии общепринятых методов не существует. По имеющимся данным, предварительная гистологическая обработка ткани на метахроматическое окрашивание не влияет. Правда, фиксация и заливка способны ослабить метахромазию. Однако это влияние незначительно. Потеря растворимых мукоидных веществ может быть предотвращена использованием замораживания — высушивания и фиксацией в парах формалина. Криостатные срезы с непродолжительной последующей фиксацией также дают хорошие результаты.

Из химических фиксирующих средств можно выбрать смеси, рекомендуемые для фиксации кислых мукоидных веществ.

Важной предпосылкой успеха, исследований с метахромазией является химическая чистота используемого красителя. Это же касается флуоресцентных' красителей, из которых наиболее часто используют акридиновые красители (акридиновый желтый, акридиновый оранжевый, корифос-фин, бензофлавин) и псевдоизоцианин.

Поскольку все приемы последующей ббработки срезов влияют на метахромазию, необходимо перед заливкой в водорастворимую среду или перед обезвоживанием в спирте и заключением в безводную среду просматривать окрашенные срезы под покровным стеклом, наложенным на срез с дистиллированной водой или средой, в которой проводилось растворение красителя.

2. РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОЛЛОИДНЫХ МЕТАЛЛОВ

Целый ряд катионов металлов, подобно катионным красителям, образует с анионами кислых мукоидных веществ соединения по тому же принципу, что и катионные красители. В гистохимии до сих пор в первую очередь ис* пользовались методы соединения коллоидного железа с кислыми мукоидными веществами. Помимо этого, использовались также коллоидный хлорид золота и ионы бария. В сочетании с основными красителями ионы алюминия, по-видимому, влияют лишь на интенсивность окраски или флуоресценции. С точки зрения гистохимика, наиболь-

4. Гистохимия отдельных классов веществ щ ферментов 121

шее практическое значение для световой микроскопии в настоящее время имеют реакции связывания железа. Торий, барий и висмут используются главным образом для контрастирования кислых мукоидных веществ на ультра-тонких срезах.

Реакции связывания железа

Метод, разработанный Хэйлом (Hale, 1946), основан на связывании Fe3+ с кислыми мукоидными веществами и последующем выявлений связанного железа при помощи ферроцианида калия (реакция берлинской лазури). Есть достаточные основания считать, что положительно заряженные частички золя железа связываются в первую очередь с карбоксильными группами и группами сульфоновой кислоты кислых мукоидных веществ, при условии что рН используемого коллоидного раствора железа не превышает 2,0. Нуклеиновые кислоты и белки связывают коллоидную гидроокись железа в гистологических срезах, по-видимому, лишь при более высоких значениях рН.

3. ОКРАШИВАНИЕ АЛЫ1И АНОВЫМ СИНИМ

Альциановый синий 8 GS, фталоцианин меди, содержащий до четырех групп изотиурония, обусловливающих его растворимость, был впервые использован в гистохимии для выявления кислых мукополисахаридов Стидменом (Steedman, 1950).

Водорастворимый краситель образует с полианионами сильноокрашенные нерастворимые в воде пигменты. Аль-циановому синему 8 GS позднее пришел на смену альциановый синий 8 GX, который по сравнению с 8 GS имеет более высокую растворимость. К альциановому синему по своим свойствам приближаются альциановый зеленый 3 ВХ и альциановый зеленый 2 GX.

Специфичность окрашивания альциановым синим можно контролировать. При этом играют роль три следующих фактора: условия окрашивания, предварительная химическая и ферментативная обработка. Так, при длительном окрашивании выявляются почти все компоненты ткани, тогда как при менее длительном (около 30 мин)

122 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

удается более или менее специфично выявить муцины эпителиального и соединительнотканного происхождения. Различия между сульфатированными и несульфатиро-ванными мукоидными веществами наиболее надежно устанавливаются при определенных значениях рН раствора красителя и при добавлении электролитов. Использование раствора красителя с рН 1,0 позволяет выявить лишь кислые мукоидные вещества с сульфатными и сульфо-новыми группами, тогда как при рН 2,0 выявляются главным образом мукоидные вещества, содержащие группы уроновон кислоты. Мукоидные вещества, содержащие сульфатированные и карбоксильные группы, связывают альциановый синий при более низких концентрациях электролитов (концентрация MgCl2 ниже 0,3 М), тогда как при кон

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)