Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

центрациях MgCl2 0,8 М и выше окрашиваются исключительно мукоидные вещества, содержащие S04-rpynnbi. И наконец, в присутствии электролитов (НС1, NaCl, КС1) окрашивание альциановым синим усиливается. Влияние электролитов на связывание альцианового синего свидетельствует в пользу ведущей роли электростатических сил при связывании альцианового синего с субстратом.

4. ОКРАШИВАНИЕ АСТРАСИНИМ

Астрасиний, будучи красителем из группы фталоциани-нов меди, близкородствен алыгиановому синему. В кислых средах этот краситель проявляет выраженное сродство по отношению к мукополисахаридам. Механизм окрашивания, однако, еще далеко не ясен. В отличие от окрашивания альциановым синим продолжительность окраски астрасиним не оказывает существенного влияния на результаты окраски.

5. ВЫЯВЛЕНИЕ БАЗОФИЛИИ

Отделить кислые мукоидные вещества от нейтральных и отдифференцировать сульфатные, фосфатные и карбоксильные группы можно путем выявления базофилии. Этот метод основан на определении способности элементов ткани связывать основные красители при различных значе-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 123

ниях рН. В процессе окрашивания забуференными растворами метиленового синего с различными значениями рН установлено, что по мере снижения этих значений окрашивание отдельных структур ослабляется (так называемая эк-стинкция метиленового синего, табл. 27). В гистохимии

Таблица 27

Окрашивание анионных групп метиленовым синим при различных значениях рН

рН Окрашиваемые группы или вещества

1,5 2,8 4,0 5,0 so4 ' | COOI-hVo SO^ | кислые мукоидные вещества Все кислые группы Нейтральные мукоидные вещества

i' Группы в скобках ионизированы и поэтому также дают окрашивание.

полисахаридов представляют интерес значения рН ниже 4,0, поскольку лишь в этих условиях теряют свой заряд анионные группы белков, значительно осложняющие интерпретацию результатов. Это особенно касается повсеместно распространенных карбоксильных групп, связанных с белками.

Нуклеиновые кислоты, которые при рН 3,0 также связывают метиленовый синий, могут быть отдифференцированы от углеводов, исходя из их локализации, а также при помощи специфических реакций. Кроме того, нуклеиновые кислоты удается исключить добавлением MgCl2 к раствору красителя. Вместо метиленового синего для определения базофилии можно пользоваться растворами аз ура А (0,02%) в НС1 — фосфатном или фосфат — нитратном буфере

6. МЕТОДЫ БЛОКИРОВАНИЯ КИСЛЫХ ГРУПП

Воздействуя метанол—НС1, метанол—тионилхлори-дом и метанол—метилиодидом, удается блокировать кислые группы (карбоксильные, фосфатные и сульфат-

124 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ные) и ослабить базофилию и метахромазию элементов ткани. С помощью метилирования по Фишеру и Лилли (Fisher, Lillie) можно блокировать метахромазию растворимых кислых групп уже при 37°С и сравнительно непродолжительном воздействии (так называемое мягкое метилирование):

на

- СООН + СН3ОН -+ - СОО сн3 + н2о,

НС1

- СН ¦ О SO3 Н + + СН3ОН ^ - СН О • СНз + h2so4 .

Обработка метилированных срезов гидроокисью калия снимает метилирование и восстанавливает базофилию. Как правило, однако, на деметилированных срезах метахромазия ослаблена. Это явление, по-видимому, связано с тем, что метилирование сопровождается десульфирова-нием без последующего восстановления прн омылении слабым щелочным раствором.

Помимо карбоксильных групп метилиодид блокирует также и другие реакционноспособные группы различных классов веществ (табл. 28). Следует признать, что алкилирование карбоксильных групп происходит специфическим образом.

Таблица 28

Алкилирование концевых групп в тканях метилиодид ом (Pearse, 1968)

Группы Алкилирование Врем» (+4^С), ч

Карбоксильные + 6-18

Фосфатные + 18-24

О-сульфатные 0 24

N-сульфатные 0 24

Амино + 4

Гуанидин 0 24

Тирозин + 6

Сульфгидрильные + 1

Гликольные 0 24

Триптофан 0 24

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 125

7. УДАЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮО ФЕРМЕНТОВ

Для идентификации кислых мукоидных веществ наиболее часто используют тиалуронидазы и нейраминидазы.

а) Расщепление гналуронидазов

Г иалуронидаза, выделенная из семенников, отличается по механизму действия от бактериальной гиалуронидазы. Так, гиалуронидаза пневмококков отщепляет лишь гиалу-роновую кислоту, а гиалуронидаза, выделенная из семенников, гидролизует не только гиалуроновую кислоту, но и хондроитинсульфаты А и С (табл. 29).

Таблица 29

Действие различных гиалуронадаз на кислые мукоовлнсахариды

Гил кислого 1укополнсахарида Тип ткани Источник гиалуронидазы иалииовый хряпддупочныйкаиатик семенники быка пневмококки

(ондоитинсульфат А В "иалуроновая С :ислота Имеется Не имеется Имеется Не имеется Не имеется То же Имеется Расщепляет Не действует Расщепляет Не действует То же Расщепляет

Гиалуронидаза, выделенная из семенников, может содержать Р-глюкуронидазу, р-гексозаминидазу и Р-галакто-заминидазу. Активность рибонуклеазы, встречающейся в виде примеси в препаратах гиалуронидазы, можно специфически блокировать перекисью водорода, Си2+ и Fe3+.

В большинстве проводимых в настоящее время исследований с использованием гиалуронидазы применяют обычно легкодоступный фермент, выделенный из семенников быка.

б) Расщепление 1*ейрамшшдазой (сиалидазоб)

Для гистохимической идентификации мукоидных веществ, содержащих сиаловую кислоту, можно использовать нейраминидазы, выделенные из противогриппозной

126 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

вакцины, а также из культур Clostridium perfringens и Vibrio cholerae. В гистохимии обычно используют очищенный фермент из культур вибрионов. При этом следует учитывать, что буфер, не содержащий нейраминидазы, переводит в раствор значительную часть связанной нейраминовой кислоты в составе сиаломукоидов. Косвенное определение нейраминовой кислоты с помощью нейраминизады в срезах ткани возможно лишь при существенном различии в интенсивности окраски альциановым синим после инкубации в буфере без фермента и после обработки нейрами-нидазой. Количественные выводы делать при этом нельзя. Равным образом невозможно выявлять нейраминовую кислоту альциановым синим после метилирования и деме-тилирования, поскольку при метилировании сульфатиро-ванные мукоидные вещества и сиаломукоиды из-за потери своих кислых групп ведут себя сходным образом.

4.3.2.4. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА

В живых клетках гликоген диффузно распределен по цитоплазме преимущественно в форме субмикроскопических мельчайших частиц. Он служит хранилищем энергетических запасов животного организма. В растениях место гликогена в качестве резервного углевода занимает крахмал. В зависимости от степени полимеризации различные гликогены различаются по растворимости. При электронно-микроскопическом исследовании частицы гликогена можно разделить по размеру на 3 группы: 1) 130 А; 2) 1500 А; 3) 3000 А. Наблюдаемые в световом микроскопе частицы гликогена в электронном микроскопе имеют вид розеток. При гистохимическом исследовании удается идентифицировать лишь ту фракцию тканевого гликогена, которая растворима в трихлоруксусной кислоте (лиогли-коген), тогда как фракция, связанная с белками (десмогли-коген), остается неокрашенной. Таким образом, положительный результат пробы на гликоген зависит от присутствия хотя бы в минимальном количестве гликогена, растворимого в трихлоруксусной кислоте (например, в ткани печени 6 мкг/100 г).

Специфических методов гистохимического выявления гликогена не существует. Для практических целей рекомен-

Таблица 30

Методы гистохимического выявления гликогена

Метод \ Принцип реакции Авторы Примечания

Реакция с иодом Гликоген окрашивается иодом в темно-коричневый цвет Mancini (1944, 1946) Стабильность связи гликоген - иод повышается в результате перевода в комплекс гликоген - иод -ртуть

Хромовая кислота -Шифф Окисление хромовой кислотой; выявление образующихся альдегидных групп реактивом Шиффа Bauer (1933) Окрашиваются различные компоненты ткани, которые не содержат гликогена

Тетраацетат свинца-Шифф Расщепление С-С-связей полисахаридов; выявление образующихся альдегидных групп реактивом Шиффа Shimizu, Kumamoto (1952) Четкое выявление гликогена

ШИК-реакция Окисление йодной кислотой; выявление образующихся альдегидных групп реактивом Шиффа McManus, Findley (1949) Доля полисахаридов, выявляемых помимо гликогена, больше, чем в реакции Бауера

Кармин по Весту Эмпирическое окрашивание, зависящее от физических и стерео-химических факторов Best (1906) Пригоден для повседневных исследований

Метод серебренш Выявление при помощи растворов солей серебра альдегидных групп, образующихся в результате окисления Arzac, Flores (1949), Gomori (1946), Lud-wig (1951, 1952) Требуется параллельный контроль для проверки специфичности

128 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

дуется использовать ШИК-реакцию в сочетании с диастазов и окрашиванием кармином по Бесту (табл. 30).

43.2.5. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ, ПЕКТИНА И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

4.3.2.5.1. ГЛЮКОЗА

Гистохимическое выявление глюкозы основано на осаждении ее барием. Комплекс глюкозы с барием восстанавливает соли серебра до гранул серебра, имеющих черный цвет. Ценность этой гистохимической реакции, к сожалению, ограничена тем, что с ее помощью выявляются главным образом нефизиологические концентрации глюкозы. Для .специальных исследований используют метод Окамото, модифицированный Мюллером (Miiller, 1955).

4.3.2.5.2. ПЕКТИН

Аминная реакция Крайсиновича (Krajcinovic, 1954, 1955), которая считается специфической для пектина, в своей основе имеет образование соединения между пектиновой кислотой и бензидином. После диазотирования свободных концевых NH2-rpynn в результате обработки В-нафтолом образуется азокраситель красного цвета.

4.3.2.5.3. АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА

В основу гистохимического выявления аскорбиновой кислоты (витамин С) легло наблюдение

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)