Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

д, выступивший на первый план с середины пятидесятых годов, получает решающий импульс от формирующихся как раз в это время количественной гистохимии и электронно-микроскопической гистохимии. Следует здесь упомянуть также постоянно совершенствующиеся количественные микрометоды в комбинации с выделением клеток и клеточных компонентов.

Развитие новых, особых подходов, которые представляли собой комбинацию гистохимических методов с мето-

10 1. Введение

дами другого характера, способствует повышению информативности гистохимии. И наконец, становлению функционального подхода способствует использование таких оптических методов, как поляризационная и флуоресцентная микроскопия и особенно радиоавтография. Следует также отметить все более настойчивые попытки повысить информативность получаемых результатов путем выявления физико-химических механизмов гистохимических реакций. Большие надежды по праву возлагаются на имму-ногистохимию—метод, отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью.

Разнообразие гистохимических методов и их широкое использование в биологии и медицине еще раз доказывает, что в этой современной отрасли морфологических исследований будущее за гармоничным сотрудничеством исследователей, достигших высокой квалификации в своих областях.

2. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИИ

Гистохимические методы, как правило, складываются из двух компонентов:

1) подготовка ткани,

2) гистохимическая реакция.

Поскольку подготовка ткани играет решающую роль в успехе последующей гистохимической реакции, на нее следует обращать соответствующее внимание. Главной задачей предварительной подготовки является такое сохранение исследуемых веществ в тканях и клетках, при котором можно судить об их прижизненном состоянии. При этом необходимо перевести исследуемую ткань из лабильного состояния живого вещества в стабильное. Для этой цели используются два метода:

1) Консервирование нативного материала глубоким замораживанием.

2) Химическая фиксация.

Для сохранения прижизненной структуры в тканях пригодны оба этих подхода. Тонкие срезы получают с помощью « микротома. При этом используются обычные приемы гистологической техники.

Гистохимическая реакция проводится на тонких срезах. Продукт гистохимической реакции должен быть или окрашенным для обычной микроскопии, или обладать способностью давать свечение для флуоресцентной микроскопии.

При использовании гистохимической реакции для научных или диагностических целей следует соблюдать два условия:

1. Гистохимическое выявление, насколько это возможно, должно быть специфичным. Для выполнения этого требования необходимо проведение соответствующих

13 2. Методы гистохимии

контрольных реакций или параллельных биохимических исследований.

2. Реакцию по возможности следует оценить количественно при помощи стандартизованного метода.

3. Результаты реакции должны по мере возможности указывать на место прижизненной локализации исследуемого вещества (вплоть до ультрасгруктурного уровня). Короче говоря, гистохимическая реакция должна безошибочно маркировать место локализации.

4. Продукт гистохимической реацня должен быть связан с тканевыми и клеточными структурами. Это условие может быть выполнено линь в том случае, если в нропессе прохождения реакции ткань подвергается самому минимальному воздействию.

В последних двух пунктах требования гистохимиков строже требований гистологов, которых, как правило, заботят лишь то, как сохранить структуру и избежать грубых сжатий и набуханий в срезах ткани.

2.1. МЕТОДЫ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ТКАНИ

21.1. ЗАМОРАЖИВАНИЕ - ВЫСУШИВАНИЕ* {ЛИОФИЛЬНАЯ СУШКА)

Метод замораживания—высушивания основан главным образом на том, что путем замораживания удается полностью остановить все жизненные щюоессы, избегая при этом химической фиксация и обычного обезвоживания ткани, что позволяет исключить ала свести до минимума всевозможные химические и физические изменения в ткана. Следует добавить также, что потери даже легкорастворимых веществ яра замораживании—высушивании полностью или по крайней мере почти полностью устраняются. Преимущество метода заключается в том, что удаление воды из ткана происходит без смещения я потерь вещества, а также в том, что не происходит денатурирования тканевой структуры.

Эти щреимушесгва сопряжены, однако, со значительными техническими трудностями. Рекомендуется тщательно продумывать процедуру замораживания—высушивания.

2. Методы гистохимии 13

Метод замораживания—высушивания складывается из трех этапов:

1) замораживание ткани,

2) сублимация воды из замороженной ткани,

3) пропитка высушенной ткани парафином.

2.1.1.1. ЗАМОРАЖИВАНИЕ ТКАНИ

При помощи быстрого замораживания ткани—важнейшего этапа лиофильной сушки—достигается полная остановка всех жизненных процессов и стабилизация структуры ткани. Химических и морфологических изменений при этом не происходит. Замораживание кусочков ткани проводят в соответствующей жидкости, например в изопентане, к-пентане или фреоне, которые лучше всего охладить до —180° С жидким азотом. Благодаря этому достигается мгновенное и достаточно глубокое замораживание воды в ткани. Крупные кристаллы льда, способные повредить структуру замороженной ткани, в таких условиях не образуются. Образование многочисленных мелких, равномерно распределенных кристалликов льда, наоборот, способствует сохранению структуры. Рекомендуется замораживать не слишком большие кусочки ткани.

2.1.1,2. ВЫСУШИВАНИЕ ТКАНИ

- Процесс высушивания состоит из двух фаз: основное высушивание и заключительное высушивание. В процессе основного высушивания сублимируется вода, находящаяся в ткани в виде кристаллического льда (98—99% всей воды ткани). Остатки влаги (2—4%) удаляются заключительным высушиванием при повышенной температуре. Исследования показали, что нет необходимости стремиться к полному удалению остатков влаги, поскольку присутствие 1—2% воды в ткани не мешает заливке. Кроме того, определенный процент воды в макромолекулах, например в белках и нуклеиновых кислотах, необходим для сохранения макромолекулярной структуры.

Успех основного высушивания зависит в значительной мере от соответствия режимов давления и температуры. Продолжительность высушивания зависит от темпера-

14 2. Методы гистохимии

туры: более высокая температура замороженной ткани обусловливает более высокое давление пара, что ведет к более быстрому высушиванию. Оттаивания материала в процессе высушивания необходимо избегать, поскольку при этом может происходить смещение структур.

При выборе температуры высушивания следует исходить из того, что в клетках и в межклеточном пространстве ткани имеется раствор, точка замерзания которого зависит от концентрации в нем солей. Поскольку вследствие испарения воды в процессе сушки концентрация солей постоянно возрастает, точка замерзания снижается.

Минимальная температура замерзания раствора, зависящая от концентрации солей, определяется как эвтектическая точка. Практически в этой точке вода насыщена растворенным в ней веществом. Оптимальный режим высушивания осуществляется лишь в том случае, когда температура ткани вплоть до заливки в парафин лежит ниже эвтектической точки. Эмпирически установлено, что требуемым условиям удовлетворяет интервал температур

о 5 ю ts го Время сушки, ч

Рис. 1. Уменьшение влажности ткани в процессе сушки при —20° С.

I—основное высушивание; II—заключительное высушивание

от —45 до —55° С. Органы, богатые неорганическими солями, подлежат высушиванию при — 55 С. При температурах от -45 до -60° С необходим вакуум по меньшей мере 10 3 мм рт. ст.

2. Методы гистохимии 15

Температуру ткани, которую на протяжении всего процесса сушки необходимо поддерживать ниже эвтектической точки, регулируют с помощью охлаждающих смесей или элемента Пельтье. В качестве охлаждающих смесей используют смеси ацетон—сухой лед, спирт—сухой лед, этилоксалат—углекислота, нонан—изопропаловый эфир, а также твердую углекислоту. Температуру первых двух смесей можно регулировать дозированием сухого льда. Преимущество элемента Пельтье заключается в том, что его легко регулировать, а также в возможности нагрева и расплавления заливочной среды путем перевода потока в обратное направление.

Динамику отдачи воды в процессе сушки можно проследить по рис. 1. Перелом кривой в том месте, где оканчивается равномерная и быстрая отдача воды, обозначает переход от основного высушивания к заключительному. В этой точке в ткани еще остается от 3 до 4% остаточной влаги.

2.1.1.3. ЗАЛИВКА ВЫСУШЕННЫХ ТКАНЕЙ

Следующий за высушиванием этап—заливка материала—является важным процессом, поскольку неправильная обработка даже хорошо высушенной ткани может привести к значительным нарушениям структуры. Высушенный материал можно заливать в следующие заливочные среды: парафин, поливаксы (например, акваффин, карбовакс 1000, 1500, 4000), целлоидин и комбинация целлоидина с парафином. Заливка в поливаксы (карбо- и оксид-ваксы) рекомендуется при исследованиях липидов, поскольку при парафиновой заливке возможны их потери и смещения. Хорошие срезы на микротоме получаются при заливке в смеси из 3 частей карбовакса 1500 или карбо-вакса 1000 и одной части карбовакса 4000. Искусственные смолы, например метакрилат, менее пригодны для заливки высушенных тканей, поскольку они вызывают нарушения структуры тканей.

Пропитка высушенного исследуемого объекта может проводиться или в самом аппарате для сушки, или вне его в специальном сосуде с заливочной средой. При заливке в аппарате для сушки сосуд с парафином нагревается на

16 2. Методы гистохимии

водяной бане. При втором методе удается избежать нежелательного съеживания материала, так как ткань после высушивания нагревается до комнатной температуры.

Залитые парафиновые блоки для защиты от воздействия воздуха следует хранить над СаС12 в эксикаторе. При хранении блоков в холодильнике ферментативная активность сохраняется несколько недель.

2.1.1.4. ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА ВЫСУШЕННОЙ ТКАНИ

При приготовлении срезов с объектов, высушенных в замороженном состоянии,

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)