Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

о-синий, а нейтральные мукоидные вещества в красный цвет различных оттенков. Эта комбинация двух методов дает контрастную гистологическую картину при исследовании ткани почек и кожи.

ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ АЛЬЦИА-НОВЫМ СИНИМ 8GX ПО СТИДМЭНУ (STEEDMAN, 1950)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: забуференный формалин, формалин — этанол, формалин—цетилпиридин, Карнуа, Буэн, заливка в парафин (можно использовать также и нефиксированные замороженные срезы).

2. Депарафинированные срезы провести через ряд спиртов убывающей концентрации до дистиллированной воды.

3. Окрашивание в свежеотфильтрованном растворе алышанового синего 8 GX (1% или 0,1%) в 3%-ной уксусной кислоте, 10—30 мин.

4. -Промывка в дистиллированной воде.

5. Окрашивание ядер ядерным прочным красным.

6. Тщательно промыть в проточной и дистиллированной воде.

7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации.

После п. 4 вместо окрашивания ядерным прочным красным можно провести докраску гемалауном Эрлиха, после чего следует дифференцировка в 1%-ном этаноле. С помощью обработки срезов после п. 4 1%-ным щелочным этанолом (рН 8 или выше) в течение 2 ч удается перевести краситель в нерастворимый монастральный прочный синий пигмент.

136 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

РЕЗУЛЬТАТ

Кислые мукополисахариды окрашиваются в сине-зеленый цвет.

ОКРАШИВАНИЕ АЛЬЦИАНОВЫМ СИНИМ ПРИ рН 2,5

МЕТОДИКА

Этапы 1 и 2, как и в методе Стидмэна.

3. Окрашивание в свежеотфильтрованном растворе альцианового синего 8 GX (1%) в 3%-ной уксусной кислоте (рН 2,5), 30 мин.

4. Промыть в проточной воде, 5 мин.

5. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Слабокислые сульфатированные мукоидные вещества, гиалуроновые кислоты и сиаломуцины окрашиваются в темно-синий цвет. Сильнокислые сульфатированные муцины окрашиваются слабо или не окрашиваются вовсе.

ОКРАШИВАНИЕ. АЛЬЦИАНОВЫМ СИНИМ ПРИ рН 1,0

МЕТОДИКА

1. Срезы поместить в дистиллированную воду.

2. Окрашивание в альциановом синем 8 GX (1%) в 0,1 н. НС1 (рН 1,0), 30 мин.

3. Срезы просушить фильтровальной бумагой.

4. Обезводить в этаноле, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Окрашиваются только сульфатированные мукоидные вещества.

Большинство кислых муцинов окрашиваются сравнительно слабо.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 137

ПРИМЕЧАНИЯ

Вместо альцианового синего 8 GX можно использовать альциановый синий 8 G, альциановый синий 8 GX 300, альциановый зеленый 3 ВХ или альциановый зеленый 2 GX. Для окрашивания очень кислых мукоидных веществ рекомендуется модификация окраски альциановым синим по Гомори (1954).

МЕТИЛИРОВАНИЕ ПО БЕЛЛО (BELLO, 1956) И ГАЙЕРУ (GEYER, 1962)

МЕТОДИКА

1. Депарафинированные срезы промыть в двух сменах абсолютного этанола, а затем в двух сменах абсолютного метанола.

2. Поместить срезы в следующий раствор: 1 мл SOCl2 в 50 мл абсолютного метанола (SOCl2 добавлять медленно; раствор можно перед употреблением хранить в течение ночи), при +24° С, 4—6 ч; контрольные срезы без обработки soa2.

3. Промыть в 70%-ном этаноле и дистиллированной воде.

4. Провести соответствующее окрашивание.

РЕЗУЛЬТАТ

6-часовая обработка полностью снимает базофилию ткани. Базофилия цитоплазмы, обусловленная СООН-группами и РНК, снимается через 30 мин, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных мукопо-лисахаридов,—через 4 ч.

УДАЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ—ГИАЛУРОНИДАЗОЙ

МЕТОДИКА

1. Фиксация в одной из смесей, рекомендованных для фиксапии мукоидных веществ (стр. 133), заливка в парафин.

138 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды через ряд спиртов убывающей концентрации.

3. Обработать срезы следующим раствором: 0.3 — 0,6 мг/мл гиалуронидазы из семенников в 0,1 н. фосфатном или ацетатном буфере (рН 6,0), 4—6 ч при + 37°С.

Контрольные срезы инкубировать в буфере в таких же условиях.

4. Окрашивание контрольных срезов и срезов, обработанных в растворе гиалуронидазы, 0,1%-ным толуидиновым синим, 1—2 ч.

5. Тщательно промыть в дистиллированной воде.

6. Заключить в глицерин—желатину или после обезвоживания и просветления в ксилоле—в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Метахроматическое окрашивание, присутствующее в контрольных срезах и отсутствующее в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствует о наличии гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфатов А и С.

ПРИМЕЧАНИЯ

Переваривание гиалуронидазой может усиливать или вызывать предварительное окисление некоторых структур уксусной кислотой. Добавление NaCl усиливает активность фермента. Для гиалуронидазы из семенников оптимальная концентрация NaCl лежит между 0,07—0,17 М. Примесь к ферментам основных белков приводит к связыванию и маскированию анионов кислых мукоидных веществ, что создает ложную картину действия гиалуронидазы.

УДАЛЕНИЕ СИАЛОМУЦИНОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ- НЕЙРАМИНИДАЮЙ

МЕТОДИКА

1. Фиксация в холодном формалин — этаноле или формальдегиде; криостатные срезы или заливка в парафин.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 139

2. Депарафинированные срезы поместить в дистиллированную воду, а затем инкубировать 6—24 ч при 39—41°С в растворе нейраминидазы (Vibrio cholerae) следующего состава: 500 ед/мл нейраминидазы в равном объеме 0,1 М ацетатного буфера. Раствор содержит, кроме того, 1% NaCl и 0,1% СаС12, рН 5,5.

3. Контрольные срезы инкубировать в 0,05 М буфере в аналогичных условиях.

4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.

5. Окрашивание альциановым синим или альциановым синим - ШИК.

6. Обезвоживание, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Об удалении сиаломуцинов свидетельствуют различия в окрашивании контрольных срезов и срезов, обработанных ферментом.

ОКРАШИВАНИЕ КАРМИНОМ ПО БЕСТУ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОГЕНА

МЕТОДИКА

1. Фиксация в одной из смесей, перечисленных на стр. 44, заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы довести до абсолютного спирта.

Зт Целлоидировать срезы путем помещения в 1%-ный раствор целлоидина (в смеси из равных частей этанола и эфира), 2 мин.

4. Просушить срезы на воздухе, уплотнить в 70%-ном этаноле и поместить в дистиллированную воду.

5. Провести интенсивное окрашивание ядер в гемалау-не по Майеру (Mayer).

6. Тщательно промыть в дистиллированной воде.

7. Окрашивание в красящем растворе кармина, 10—20 мин. Маточный раствор кармина: 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия растворить в 60 мл дистиллированной воды и кипятить несколько минут на

140 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

слабом огне. Раствор после охлаждения отфильтровать и добавить 20 мл аммиака. Раствор готов к непосредственному применению и может храниться в течение нескольких недель (в холодильнике до 3 мес).

Красящий раствор кармина: 20 мл профильтрованного маточного раствора кармина, 30 мл аммиака, 30 мл метанола (сохранность несколько дней!).

8. Срезы перенести непосредственно в смесь для дифференцирования (в двух порциях смеси дифференцировать до того момента, как видимые глазом следы красителя перестанут выходить из среза в раствор), от нескольких секунд до нескольких минут.

Смесь для дифференцирования: 40 мл метанола, 80 абсолютного этанола, 100 мл дистиллированной воды.

9. Промыть в 80%-ном этаноле, провести через ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Гликоген окрашивается в интенсивный красный цвет, ядра—в темно-синий.

ПРИМЕЧАНИЯ

Окрашивание кармином по Бесту рекомендуется особенно в тех случаях, когда в изучаемой ткани помимо гликогена присутствуют в больших количествах другие ШИК-положительные вещества.

Целлоидирование срезов после депарафинирования должно защищать гликоген от вымывания. Этот этап, однако, может считаться излишним, если была проведена химическая фиксация (Barka, Anderson, 1964). Поскольку гликоген в животных тканях бесспорно имеет различную степень полимеризации, то необходимо в каждом случае находить оптимальные условия для окрашивания. Изменения в степени полимеризации могут наблюдаться у одного животного даже в течение дня.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 141

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ДИАСТАЗОЙ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ГЛИКОГЕНА

МЕТОДИКА

1. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды.

2. Обработать в 1%-ном растворе диастазы при комнатной температуре, 2 ч.

3. Промыть в дистиллированной воде и провести окрашивание на гликоген (ШИК-реакция или окрашивание кармином по Бесту).

РЕЗУЛЬТАТ

Вещества, которые в прямом опыте окрашиваются при ПТИК-реакции или кармином по Бесту, но исчезают из среза после обработки диастазой, следует считать гликогеном.

ПРИМЕЧАНИЯ

Различие между молекулами гликогена с разветвленными и неразветвленными цепями могут быть выявлены в срезах путем обработки 0,5%-ной Р-амилазой в 0,004 М ацетатном буфере (рН 5,0) вместо а-амилазы. р-Амилаза расщепляет только молекулы с разветвленными цепями.

4А. ЛИПИДЫ

Под собирательным термином липиды понимают группу природных, преимущественно неполярных соединений, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липоидами принято называть все жироподобные вещества, кроме нейтральных жиров. Иногда, однако, термин липоид используют как синоним слова липид. Липиды, как правило, растворимы в эфире, этаноле, хлороформе, ацетоне, пиридине и т. п. Способность растворяться в органических растворителях и другие физические свойства липидов объясняются высоким содержанием неполярных

142 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

остатков углеводородов. На их растворимости основаны : 1) выявление липидов с помощью жирорастворимых красителей и 2) классификация липидов, присутствующих в тканях.

В тканях млекопитающих липиды обычно связаны с белками. Липопротеидные комплексы образуют также так называемые «маскированные» липиды, т. е. липиды, выявление которых, как правило, возможно лишь при разрушении связи липид — белок. Именно потому, что липиды встречаются в виде смесей,

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)