Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

лезным гематоксилином в деталях еще не выяснен, но предполагается, что в окрашивании играет роль катионный хелат, обладающий способностью связывать ионы железа с фосфатными группами.

При менее специфичном методе с фталоцианином меди по Клюверу и Баррере (Kliiver, Ваггега) происходит связывание красителя с остатком холина в фосфолипидах.

Предполагается, что в спиртовых р/астворах реакция протекает согласно следующему механизму:

// . Фталоцианин меди R-0-P-0

чоснгснгЫ(СНз13 + iCuPOSOsH- Основание—*-о

R-О-Р-0

ОСНгСН2М(СНз)э03$(СиРС) + Основание

Люксоловый прочный синий ARN и люксоловый прочный синий G образуют комплексы с фосфолипидами в 0,1%-ных растворах в абсолютном этаноле. Сравнительно низкая специфичность окрашивания люксоловыми красителями компенсируется их значением для обзорных ней-рогистологических исследований.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и Ферментов 157

2. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ЛИПИДЫ

Для выявления ненасыщенных липидов пригоден метод четырехокись осмия-а-нафтиламин (Os04-HA) по Адамсу (Adams) в сочетании со вспомогательными реакциями. В этой реакции гидрофобные липиды в результате окисления 0s04 до Os02 окрашиваются в черный цвет, тогда как гидрофильные липиды, образуя хелатные комплексы с осмий — нафтиламином, окрашиваются в красный цвет. При помощи этого метода можно различать 3 типа липидов: а) ненасыщенные гидрофобные липиды (черный цвет), б) ненасыщенные гидрофильные липиды (красный цвет) и в) насыщенные липиды (бесцветные). При помощи метода хром — серебро по Нортону (Norton) происходит образование галогенидов серебра и их восстановление до металлического серебра с помощью фотопроявителя.

3. КИСЛЫЕ ЛИПИДЫ

Из приведенных в табл. 33 методов наиболее надежным следует считать метод установления базофилии с помощью забуференных растворов метилового синего для отграничения от кислых мукоидных веществ и нуклеиновых кислот. Выявление кислых липидов, кроме того, воз-" можно при помощи нильского синего.

4. ФОСФОГЛИЦЕРИДЫ

- Принцип, лежащий в основе метода с образованием гидроксамата золота, основан на гидроксиламинолизе жирных кислот. Образующиеся при этом гидроксамовые кислоты выявляются путем восстановления серебром и последующего их перевода в гидроксамат золота. Фосфогли-цериды окрашиваются в цвета от стабильного красного до пурпурно-красного.

5. СФИНГОМИЕЛИН

Сфингомиелин относится к липидам, устойчивым к действию щелочей. Довольно специфично сфингомиелин выявляется путем гидролиза с NaOH в сочетании с

158 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ОвО^НА-реакцией, методом Элледера—Лойды и пробой с кислым гематеином.

6. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ

В основе гистохимического выявления свободных жирных кислот лежат два принципа: а) омыление с помощью солей металлов; б) образование солей красителей в реакциях жирных кислот с некоторыми основными красителями. Среди методов, основанных на омылении—методы Фишлера (Fischler), Окамото (Okamoto), Уэда (Ueda) и Като (Kato) и др.—наиболее надежные результаты обеспечивает метод Хольцингера (Holczinger, 1959). В этом методе жирные кисдоты окрашиваются с помощью комплексного соединения (рубеановая кислота—медь) в зеленовато-черный цвет. Важной предпосылкой для получения надежных результатов является использование нефиксированных замороженных срезов свежего материала.

7. ХОЛЕСТЕРИН

Из методов гистохимического выявления холестерина своей высокой специфичностью выделяется метод Адамса (Adams, 1961) с хлорной кислотой и нафтохиноном (ХКН-метод). Достаточной гистохимической специфичностью обладает окислительный метод Шульца (табл. 33) с железными квасцами.

Выявление холестерина В методе с хлорной кислотой и нафтохиноном хлорная кислота образует с холестерином нерастворимый хлорат.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и Ферментов 159

При избытке хлорной кислоты эта соль теряет одну молекулу воды. При этом образуется холеста-3,5-диен.

В последующей реакции с 1,2-нафтохинон-4-сульфоно-вой кислотой образуется темно-синий пигмент.

8. ПЛАЗМАЛОГЕН

Впервые гистохимическое выявление плазмалогена провели Фёльген и Фойт (Feulgen, Voit, 1924) при помощи разработанной ими так называемой плазмалевой реакции. Впоследствии этот метод неоднократно модифицировался. По-видимому, плазмалевая реакция достигает максимальной интенсивности лишь при использовании ионизированных соединений ртути; при этом ртуть встраивается в структуру плазмалогена. Этот же принцип реакции был использован в плазмалевой реакции Хайеса (Hayes, 1949). При этом в результате непродолжительного воздействия сулемы на плазмалоген отщепляются высшие альдегиды, которые становятся видимыми под действием реактива Шиффа.

9. ВЫЯВЛЕНИЕ СВЯЗАННЫХ, ИЛИ МАСКИРОВАННЫХ, ЛИПИДОВ

Липиды, существующие в тканях в невидимой форме, объединяются термином «маскированные липиды». Некоторые из них принимают участие в построении основной ' структуры цитоплазмы или находятся в клетке в виде мельчайших диспергированных коллоидных частиц. Особенно характерно образование липидами комплексов с белками. Связывание липидов с углеводами наблюдается реже. В результате связывания маскированных липидов, прежде всего с белками, их прямое выявление оказывается невозможным. Для гистохимического выявления маскированных липидов должны быть выполнены два условия: объединение мелкодиспергированных липидов в большие по размерам комплексы и разрушение связи липид — — белок.

В методе Беренбаума (Berenbaum, 1958) с использованием Судана черного В в ацетоне связанные (маскированные) липиды (хроматин, ядрышко и др.) окрашиваются в цвета от темно-серого до черного. Для установления ли-

160 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

пидной природы окрашиваемых структур необходимо проводить контрольные опыты с экстракцией.

10. ВЫЯВЛЕНИЕ КЕТОСТЕРОИДОВ

Гистохимическое выявление кетостероидов основано на замещении кетогрупп фенилгидразином (или динитро-фенилгидразином) с образованием окрашенных гидразо-нов:

R • C = 0 + H2N • NH

с-он

4NH • NH

C=N

с6н5

Поскольку образование гидразонов возможно и при наличии в исследуемом материале альдегидных групп, гистохимические методы выявления кетостероидов нельзя считать специфичными. Эти ограничения распространяются и на метод выявления кетостероидов по Ашбелю и Зе-лигману (Ashbel, Seligman, 1949). В этом методе гидразид 2-окси-З-нафтойной кислоты конденсируется с кето- и альдегидными группами и образует гидразоны, которые в результате сочетания с солью диазония (прочный синий В), образуют азокраситель:

.он .он

// <\ г.....- /R' JT\ Pi

• NH N [H2+0*C-R -f_V-C0NH • N=C-R

R4

R-C=N HNCO OH

HO C0NHN=C-R

Продукт азосочетания

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 161

11. ВЫЯВЛЕНИЕ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП

Перечень реакций для выявления карбонильных групп приведен в табл. 34. В сочетании с реакциями иодирования может быть достигнута достаточная специфичность выявления

Таблица 34

Методы выявления карбонильных групп (Gedick, Totovic)

Фиксация

Заливка

Реакция

Окрашивание

Специфичность

Ф;

Ф-Са|

ф;

Са-Ф

Ф;

Са-Ф

Ф;

Са-Ф

П 3

Шифф

Аммиачный раствор серебра (ме-тенамин-сереб ро)

Нафтойная кислота и гидразид

Фенил-гидразин-формазан

Красно-фиолетовое

Коричнево-черное

Сине-фиолетовое

От красного до красно-коричневого

Преимущественно альдегиды,неко-торые кетоны

То же

Только альдегиды

г4.4.3.4. ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКО-¦"ПИЧЕСКОМ УРОВНЕ

Ультрагистохимия липидов находится еще в начальной фазе своего развития. Особенно трудно обеспечить сохранность липидов в процессе фиксации и последующей обработки фиксированного материала. Количественные исследования свидетельствуют о том, что дофиксация в Os04 лишь частично предотвращает потери вещества. Осмиро-вание оказывает стабилизирующее действие главным образом на ненасыщенные липиды. Связанный осмий значительно усиливает контрастирование структур. Этот факт играет, однако, лишь незначительную роль в идентификации липидов, поскольку Os04 образует электроноплотные соединения и с другими веществами. В табл. 35 представлен перечень ультрагистохимических методов выявления липидов.

.6-235

Таблица 35

Ультрагистохимическое выявление'липидов (Geyer, с изменениями)

Выявляемые липиды Метод Авторы Примечания

Триглицериды Фосфоглицериды Холестерин Ферментативное отщепление жирных кислот Реакция образования гидроксамовых кислот Реакция холестерин-ди-гитонин Adams, Abdulla, Bayliss, Weller (1966) Gallyas (1963); Weller, Bayliss, Abdulla, Adams, (1965) " Scallen, Dietert (1969) Специфичность метода зависит от чистоты препарата липазы Положительно реагируют гидрофильные фосфоглицериды и гидрофильные триглицериды с очень короткими цепями; продуктом реакции являются крупные электроноплот-ные гранулы серебра Реакция сопровождается некоторым смещением выявляемого вещества

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 163

4.43.5. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

ОКРАШИВАНИЕ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ В ПО ЛИЗОНУ (LISON, 1960) МЕТОДИКА

1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные срезы или заливка в поливакс.

2. Промыть в 70%-ном этаноле.

3. Окрасить Суданом черным В (насыщенный раствор Судана В в 70%-ном этаноле перед использованием фильтровать!), 20—30 мин.

4. Промыть в 70%-ном этаноле, 30 с.

5. Быстро промыть в дистиллированной воде.

6. Окрасить 1%-ным ядерным прочным красным, 1 мин.

7. Быстро промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину или в глицерин по Целлеру.

РЕЗУЛЬТАТ

Липиды окрашиваются в цвета от черного до темно-синего, ядра окрашиваются в красный цвет. Окрашиваются также и фосфолипиды.

ПРИМЕЧАНИЯ

Для контроля неспецифического окрашивания за счет адсорбции можно воспользоваться экстракцией ацетоном или этанолом.

ОКРАШИВАНИЕ МАСЛЯНЫМ КРАСНЫМ О В ИЗОПРОПАНОЛЕ ПО ЛИЛЛИ (LILLE, 1944)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные срезы.

2. Замороженные срезы поместить в дистиллированную воду и быстро промыт

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)