Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

следующим выявлением ферментативной активности Гель-фильтрация, ионообменники, электрофорез

возможности: метод микропрепарирования и метод гомогенизации цельной ткани. Метод микропрепарирования позволяет судить о свойствах фермента в одной клетке или группе клеток. В связи со значительными трудностями в освоении этого метода, а также с необходимостью в специальном оборудовании этот метод крайне редко используется в гистохимических лабораториях для изучения ферментов. В большинстве лабораторий используется метод работы с гомогенатами из больших тканевых комплексов. Для сравнения свойств ферментов можно рекомендовать их разделение с помощью диск-электрофореза. Этим методом удается установить ферментный состав определенных участков ткани и дать направление последующему энзимо-химическому анализу.

Существующие в настоящее время методы позволяют настолько подробно охарактеризовать фермент, выявленный в срезе ткани in situ, что становится возможной оценка его функционального значения.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 177

4.5.3. ГИДРОЛАЗЫ

Эти ферменты катализируют расщепление химических соединений с присоединением воды, или же обратную реакцию с выделением воды. По типу расщепляемой связи гидролазы делятся на фосфатазы (фосфоэстеразы), эстеразы, гликозидазы, амид азы.

4.5.3.1. ФОСФАТАЗЫ

Важную группу гидролаз составляют фосфатазы, или фосфоэстеразы, которые расщепляют эфирную связь между фосфатом и остатком спирта (R):

о II

Я—О—Р— он + н2о«* ЯОН + Н3Р04 он

На фосфомоноэфиры действуют фосфомоноэстеразы. Они неспецифичны в отношении связанного с фосфатной группой радикала спирта (R) и поэтому способны стимулировать гидролиз многих органических фосфатов. По рН-оптимуму фосфомоноэстеразы можно разделить на подгруппы (табл. 37).

4.53.1.1. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЩЕЛОЧНЫЕ ФОСФАТАЗЫ (КФ 3.1.3.1)

;' Щелочные фосфатазы способны гидролизовать многочисленные фосфомоноэфирные соединения. Биологическое значение этой группы ферментов связано с обменом ну-клеопротеидов, жиров и гликогена, с процессами гликонео-генеза и регенерации, как, например, при росте костей, а также с эмбриогенезом На основании электронно-микроскопических исследований щелочная фосфатаза была отнесена к группе мембранных ферментов, функции которых связаны с различными процессами, протекающими в мембранах.

Методы гистохимического выявления этих ферментов основаны на выявлении фосфорной кислоты (метод с соля-

Разделение фосфомоиоэстераз по рН-оптимуму

Таблица 3

Фермент

рН-оптимум

Ингибиторы

Активаторы

Фосфомоноэстераза I (щелочная фосфатаза)

Фосфомоноэстераза II (кислая фосфатаза)

Фосфомоноэстераза III (растительная кис лая фосфатаза)

Фосфомоноэстераза IV

9,2-9,6

5,0-5,3

3,4-4,2

5,2-6,2

Э ДТА, цистеин, глутатион, фторид, цианид, Be , фосфат, арсенат, L-фенилаланин

Фосфат, арсенат, молиб-дат, тартрат и др. а-оксикарбоновые кислоты, Fe34-, Са2+, Zn2+, фторид; отсутствие подавления 0,5%-ным формалином

Mg2"1" (нейтральные растворы)

Cu2+, Со2+, Zn2+, Са2+ 0,5%-ный формалин слабое подавление фторидом

Аланин, Мр?+ Со2+ Мп2+ Zn2+

Отсутствуют

Mg:

,2+

ми металлов) или радикала спирта (метод с азокрасителя-ми).

НзСОН

2HC0PO/ta2 + 2Hj0 ^"^CqjPO^f + гПицерт* 4Na*+ 2H* H2C0H 00

Динатрий-2-глицерофосфат

/су*

Со$(род —*• scos (черный)

+

ЗСо**

+

2Р0*""

Метод с солями металлов 0-P0jNa2 он

осн3

осн.

На-а-нафтил а-Мартал Тетрааэотированный фосфат о-дианизидин /сом прочного

он ^ ^ ^ он синего В)

2на

продукт реакции, окрашенный в темно-голубой цвет Метод с азокрасителями

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 179

На развитие современной гистоэнзимологии огромное влияние оказал разработанный независимо друг от друга Гомори (Gomon) и Такаматсу (Takamatsu) кальций — кобальтовый метод.

Этот метод складывается из двух этапов:

1. Высвобождаемый под действием фермента неорганический фосфат осаждается в месте локализации фермента ионом металла (Са2+).

2. Превращение растворимой бесцветной соли металла СаНР04 путем обработки сульфидом аммония в видимый глазом черный сульфид металла (например, сульфид кобальта или сульфид свинца).

В последующее время в эту реакцию вносили изменения. Она послужила основой для выявления кислой фосфа-тазы, аденозинтрифосфатазы, 5'-нуклеотидазы, глюкозо-6-фосфатазы, тиаминпирофосфатазы, аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, неорганической пирофосфатазы, эсте-разы тиоуксусной кислоты.

Плохая растворимость фосфатов тяжелых металлов, а также мелкая зернистость их осадка позволяют выявлять четкую локализацию фермента.

Эти преимущества и отчетливый контраст тяжелых металлов на электронных микрофотографиях делают в принципе возможным использование метода Гомори с солями металлов для ультраструктурной локализации ферментов, высвобождающих фосфат. Благодаря легкой растворимости фосфата кобальта и сульфида кобальта в 0s04 в процессе дофиксации в электронно-микроскопических исследованиях для выявления щелочной фосфатазы вместо Са2 + используют РЬ2 +. Для предотвращения выпадения солей свинца в осадок, наблюдаемого уже при слабощелочных значениях рН, в инкубационную среду доба-, вляют комплексообразователи, такие, как тартрат, тирон, цитрат. Принцип комплексообразования зарекомендовал себя очень хорошо. Благодаря ему появилась возможность заменить методы, состоящие из двух последовательных реакций, одновременными реакциями, ведущими непосредственно к образованию конечного гистохимического продукта.

Методы с азокрасителями основаны на выявлении спиртовых радикалов. Принцип заключается в осаждении

180 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

и окрашивании с помощью соли диазония высвобождаемого ферментативным путем фенольного соединения. В результате образуется нерастворимый азокраситель. Из проверенных субстратов наиболее подходящий натрий-а-нафтилфосфат. Плодотворным оказалось также введение в гистохимию замещенных нафтола и особенно гексазоти-рованного парарозанилина в качестве сочетающих агентов. Замещенные нафтолы отличаются низкой растворимостью и высокой субстантивностью.

Основными преимуществами метода одновременного азосочетания являются следующие:

1) В значительной мере устраняется неспецифическое окрашивание и адсорбция на тканевых частицах. 2) При сокращении сроков инкубации уменьшается опасность ложной локализации.

Щелочная фосфатаза, выявляемая в пищеварительном тракте, представлена двумя хорошо изученными изофер-ментами—«интестинального типа» и «печеночного типа». Щелочная фосфатаза интестинального типа избирательно подавляется L-фенилаланином (12,5 мМ); щелочная фосфатаза печеночного типа ингибируется L-гомоаргинином (12,5 мМ), но не подавляется L-фетилалшпшом.

Для выявления щелочной фосфатазы с помощью светового микроскопа пригодны кальций — кобальтовый метод Гомори (221) и метод одновременного азосочетания. Для выявления данного фермента на электронно-микроскопическом уровне рекомендуется метод с солями свинца по Хугону и Боргерсу (Hugon, Borgers).

4.5.3.1.2. НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА (КФ 3.1.3.2)

Неспецифические кислые фосфатазы гидролизуют фос-фомоноэфиры при рН 3,8—6,0. Электрофоретические и хроматографические исследования позволили описать группу кислых фосфомоноэстераз с характерной, хотя иногда и перекрывающейся, субстратной специфичностью. Эти группы принято обозначать римскими цифрами И, III и IV. В тканях животных встречается главным образом кислая фосфомоноэстераза II с рН-оптимумом 5,0—5,3. У простейших была описана, кроме того, кислая фосфатаза с рН-оптимумом 3,0—4,0. Мультиферментный характер

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 181

неспецифической кислой фосфатазы особенно резко выражен у растений. Так, из водоросли Acetabularia mediterranea было изолировано 5 различных изоферментов кислой фосфатазы.

Биохимические и электронно-микроскопические исследования показали, что неспецифическая кислая фосфатаза, так же как и другие кислые гидролазы, локализуется главным образом в лизосомах. Поэтому она считается маркерным ферментом для лизосом (табл. 37). Поскольку лизосомы связаны своим происхождением с комплексом Гольджи, то, как и следовало ожидать, активность этого фермента выявляется также на внутренней мембране этого комплекса и цистерн гладкого эндоплазматического рети-кулума.

Результаты гистохимического выявления кислой фосфатазы, несомненно, зависят от выбора субстрата. Для гистохимического выявления фосфатаз в качестве субстрата наиболее пригодны нафтол-AS-BI- и -TR-фосфат. Методом Лойды (Lojda) с нафтол-А8-В1-фосфатом выявляется широкий спектр кислых фосфатаз. Все проведенные до сих пор исследования по электрофоретическому разделению кислых фосфатаз показали, что данные по числу изоферментов кислой фосфатазы неоднозначны. Чаще всего выделяют 3—4 типа. Кислая фосфатаза является широко распространенным ферментом, отличающимся выраженной изменчивостью.

По вопросу о выявлении кислой фосфатазы в клеточном ядре особенно с помощью методов с солями металлов ведется живая полемика. Несомненно, что концентрация ионов свинца, используемого в качестве осаждающего реагента, в значительной мере влияет на результаты реакции. Неспецифическое осаждение ионов свинца часто бывает следствием неправильного подбора концентрации ионов свинца в инкубационной среде. В связи с выявлением кислой фосфатазы в клеточном ядре следует отметить данные, предполагающие здесь наличие особого типа фосфатазы, отличающегося от кислой фосфатазы цитоплазмы.

Для гистохимического выявления неспецифической кислой фосфатазы на светомикроскопическом уровне используются в первую очередь методы с солями свинца, ос-

182 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

нованные на принципе, предложенном Гомори, и реакции с образованием азокрасителей при использовании в качестве субстрата гексазотированного парарозанилина и нафтол-AS-B1- или -TR-фосфата.

Для ультрагистохимического выявления кислой фосфатазы наиболее пригодны методы с солями свинца. Следует учитыв

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)