Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

в, например Mn2+, Mg2+, Са2 + . В условиях гистохимического исследования сравнительно устойчивая к действию фиксаторов тиаминпирофосфатаза (ТПФаза) выявляется в животных и растительных клетках преимущественно в аппарате Гольджи. Поэтому и в световой, и в электронной микроскопии этот фермент можно считать маркерным для аппарата Гольджи. В биохимических исследованиях ТПФаза может считаться маркером аппарата Гольджи лишь с оговорками, поскольку и другие фракции клетки способны катализировать гидролиз тиаминпирофосфата.

В гидролизе тиаминпирофосфата, по-видимому, принимают участие многие ферменты. Вместе с тем один и тот же фермент оказывается способным стимулировать гидролиз многих субстратов, однако с различной интенсивностью. рН-Оптимум ТПФазы в значительной мере зависит от выбора ткани, о чем свидетельствуют следующие примеры: рН-оптимум для миобластов сердца цыпленка

188 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

составляет 5,6, для нервных клеток мозга млекопитающих—7,2, а для придатка семенника мыши—9,5.

О функциональном значении этого фермента существуют различные предположения. В последнее время помимо признанной роли в синтезе кокарбоксилазы (тиамин-пирофосфата) этому ферменту приписывают роль индикатора функционального состояния секреторных клеток.

Выявление ТПФазной активности в световой и электронной микроскопии основывается на принципе осаждения солями металлов. Отщепляемый в результате реакции неорганический фосфат осаждается ионами свинца или кальция на месте реакции, а затем выявляется в форме сульфида свинца. Надежное выявление фермента с помощью световой и электронной микроскопии может быть достигнуто с помощью метода Новикова и Гольдфи-шера (Novikoff, Goldfischer).

4.5.3.1.7. НУКЛЕОЗИД-ДИФОСФАТАЗА (КФ 3.6.1.6), НЕОРГАНИЧЕСКАЯ ПИ-

РОФОСФАТАЗА (КФ3.6.1.1),3,5-ЦИКЛО-НУКЛЕОТИД - ФОСФОДИЭСТЕ-PA3A (КФ 3.1.4.17), ГЕКСОЗОДИФОСФАТАЗА (КФ 3.1.3.11), ДЕЗОКСИРИ-

БОНУКЛЕАЗА П (КФ 3.1.4.6), АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА (КФ 4.6.1.1)

Перечисленные ферменты не подвергаются здесь подробному обсуждению, хотя их гистохимическое изучение имеет большое значение. Перечень ферментов и важнейших методов представлен в табл. 39.

4.5.3.2. ЭСТЕРАЗЫ (КФ 3.1.1-)

Эстеразы расщепляют эфиры карбоновых кислот и спиртов, фенолов и нафтолов:

R—COOR' + Н20 ?± R—СООН + R'OH.

Поскольку данная реакция обратима, эти же эстеразы катализируют синтез соединений со сложной эфирной связью.

Классификация этой неоднородной группы ферментов основывается, согласно данным биохимических исследований, в первую очередь на субстратной специфичности и действии активаторов и ингибиторов (Gomori, 1955). Это

1

Таблица 39

Фермент

Нуклеозид-дифосфатаза

3'5'-цикло-нуклеотид -фосфодиэстераза

3', 5'-цикло-нуклеотид-фосфодиэстераза

Гексозодифосфатаза Дезоксирибонуклеаза II

Аденилатциклаза

Методы

Инозин-(уридин, гуанозин) дифосфат+ РЬ2+ (С и Э)»

Циклический 3',5'-АМФ+ +5'-нуклеотидаза+РЬ2+ (СиЭ)

Индигогенные методы (СиЭ)

Фруктозо-1,6-дифосфат + РЬ2+(Э)

ДНК-Ыа+Кислая фосфатаза+РЬ2+ (С и Э)

I. АТФ + РЬ2+ (С и Э)

II. 5'-аденилилимидодифосфат + РЬ2+(Э)

Авторы

Novikoff, Goldfischer (1961)

Shanta et al. (1966); Florence, Barrnett, Green-gard (1971)

Tsou (1975)

Saito, Ogawa (1968)

Zotikov, Bernhard (1970)

Reik. et al. (1970)

Howell, Whitfield 1972); Schulze et al. 1972, 1975)

Примечания

Локализация в эндоплазма-тическом ретикулуме и аппарате Гольджи

Многоступенчатая реакция с опасностью ложной локализации продуктов реакции

Необходим основной цитрат свинца как осаждающий реагент

Наиболее подходят ультратонкие срезы; следует иметь в виду возможность смещения продуктов реакции

Субстратная специфичность спорна

Специфический субстрат; опасность полного подавления активности фермента за счёт РЬ2+

I) С- световая микроскопия; Э - электронная микроскопия.

190 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

положение, однако, осложняется тем фактом, что различия между ферментами разных групп довольно незначительны, а также тем, что их субстратная специфичность в значительной мере перекрывается. Отдельные ферменты (изоферменты одной группы) могут действовать на один и тот же субстрат при тех же значениях рН. Маркерту и Хантеру (Markert, Hunter, 1959) с помощью электрофореза на крахмальном геле удалось обнаружить в экстрактах печени взрослых мышей десять различных изоферментов эстеразы, которые удалось выявить и охарактеризовать с помощью гистохимических методов окрашивания. Однако этими методами не удается локализовать отдельно различные эстеразы и установить их роль в обмене веществ на срезах ткани. Информативность гистохимических методов можно значительно повысить благодаря использованию комбинации физических и химических методов (хроматография, электрофорез) с гистохимическими в сочетании с контрольными опытами по субстратной специфичности, активации и ингибированию ферментов.

Гистохимически выявляемые эстеразы могут быть разбиты на следующие 4 группы:

1. Неспецифические эстеразы.

2. Липазы.

3. Ацетилхолинэстеразы.

4. Холинэстеразы.

Неспецифические эстеразы и липазы можно объединить в общую группу алиэстераз. Холинэстеразы удается отдифференцировать от неспецифических эстераз благодаря их чувствительности к эзерину уже при низких концентрациях (Ю-5 М). Поскольку неспецифические эстеразы способны в значительной мере гидролизовать те же субстраты, что и липазы, и наоборот, то четкое разделение между • этими двумя группами не представляется возможным. Однако, как правило, эфиры с меньшим числом С-атомов (С2 — Си) расщепляются преимущественно неспецифическими эстеразами, а эфиры с большей длиной углеводородной цепи (С12 — С18)—липазами. Длина углеводородной цепи используемого субстрата, определяемая числом С-атомов, может следовательно служить фактором, характеризующим алиэстеразы в клетках и тканях.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 191

4.5.3.2.1. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭСТЕРАЗЫ СВОЙСТВА

Олдридж (Aldrige, 1953), а также Бергман и сотр. (Bergman et al., 1957) разделили неспецифические эстеразы, гид-ролизующие эфиры с короткой углеводородной цепью в зависимости от их чувствительности к органическим фосфатам (особенно диэтил-п-нитрофенилфосфату—«Е 600» и диизопропилфторфосфату—«ДГТФ»), на 3 группы:

А-эстераза, карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1);

В-эстераза, арилэстераза (КФ 3.1.1.2);

С-эстераза, ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6).

1. А-эстеразы не подавляются ингибитором Е 600 (диэ-тил-п-нитрофенилфосфатом) в концентрации вплоть до 10~3 М; они, кроме того, устойчивы и по отношению к ДПФ. Ингибиторами для них служат ионы металлов, например Hg2+, Ni2 , Cu2+, иодацетат, а также желчные соли (таурохолат) и фтор. К активаторам относятся аминокислоты, такие, как аргинин, лизин и гйстидин. А-астеразы расщепляют ацетаты интенсивнее, чем бутираты.

Судя по данным цитохимических исследований, А-эстеразы локализуются, по-видимому, преимущественно в лизосомах.

2. В-зстеразы подавляются ингибитором Е 600 в концентрации Ю-8 М и весьма чувствительны к ДПФ. В-зстеразы гидролизуют бутираты с такой же скоростью или даже несколько быстрее, чем ацетаты. Они локализуются преимущественно вне лизосом.

- 3. С-эстеразы отличаются устойчивостью к ДПФ. Их активность подавляется солями металлов (ацетат ртути, сульфат меди и др.) и активируется л-хлормеркурибензоа-том в концентрации Ю-5 М.

Гомори (Gomori, 1955) разделил эстеразы (В-эстеразы), чувствительные й Е 600, по их отношению к NaF (фторид натрия) на КаР-резистентный панкреатический тип эстеразы и на NaF-чувствительный печеночный тип эстеразы.

ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ

Поскольку эстеразы, как правило, являются ферментами с низкой субстратной специфичностью, вопрос о выбо-

192 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ре субстрата при их гистохимическом выявлении играет особо важную роль. В каждом случае необходимо тщательно проверять, действительно ли с используемым субстратом выявляется требуемый фермент. Особенно низкой субстратной специфичностью, по-видимому, обладают на-фтилацетаты, которые расщепляются также различными протеазами (например, трипсином или химотрипсином) и карбоангидразой или глицератдегидрогеназой.

При использовании методов азосочетания (субстраты: а-нафтилацетат, -пропионат, -бутират, нафтол-AS-, -AS-D-, -AS-MX-ацетат, -пропионат, -бутират), согласно данным световой микроскопии, в клетках печени выявляются преимущественно микросомные В-эстеразы. Для одновременного выявления локализующихся в гранулярном эндоплаз-матическом ретикулуме микросомных В-зстераз и устойчивых к действию органических фосфатов лизосомных А-эстераз используются индигогенные методы с 5-бромин-доксилацетатом и 5-бром-4-хлориндодссилацетатом в качестве субстрата. 5-бром-4-хлориндоксилацетат, по-видимому, в большей мере пригоден для выявления ферментов этих двух локализаций.

Ос

с-он Эстераза^ —со н н

о

н II

о

Индиго

Принцип реакции заключается в освобождении под действием эстеразы индоксильной группы с последующим окислением этой группы и превращением ее в нерастворимый синий краситель из группы индиго.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 193

Для выявления активности ферментов, расщепляющих эфиры в лизосомах, как для световой, так и для электронной микроскопии можно рекомендовать метод с тиолук-сусной кислотой и РЬ24". Предполагается, что локализующиеся в лизосомах эстеразы, обладающие довольно высокой термостабильностью, идентичны кислым липазам. Кроме того, хорошие результаты дает метод Дайм-линга (Deimling), а также метод Даймлинга и Мадрайте-ра (Deimling, Madreiter) с использованием биохимически проверенных субстратов (табл. 40).

4.5.3.2.2. ЛИПАЗЫ

Липазы гидролизуют эфиры жирных кислот с довольно длинной цепью независимо от того, являются ли они триэ-фирами или моноэфирами. Согласно Деснуйе (Desnuelle), под липазами, как правило, понимают большую группу ферментов, гидролизующих различные эфиры, к которым могут относиться как водорастворимые, так и водонера-створимы

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)