следует полностью исключить контакт срезов с водой, а также сократить время контакта срезов с воздухом. Эти условия легче всего выполняются при нанесении лент приготовленных срезов на сухие предметные стекла. Расправление лент парафина проводится на предварительно прогретых предметных стеклах при помощи пинцета; при необходимости срезы разглаживают кисточкой. В качестве расправляющей среды можно использовать теплое минеральное масло.

Депарафинизация проводится в ксилоле, петролейном эфире или изопентане. После того как растворитель удален, причем удаление проводится только путем испарения, вновь высушенные и депарафинированные срезы подвергают дальнейшей обработке. При этом возможны три варианта:

1. Непосредственное помещение срезов ткани в реакционную смесь. В результате реакции исследуемое соединение дает нерастворимый продукт.

2. Денатурирование ткани перед помещением ее в водный раствор при помощи сухой фиксации (например, нагреванием или обработкой парами).

3. Проведение гистохимического выявления (например, радиоавтографии) на обезвоженном срезе ткани.

Практическое значение имеет лиофильная сушка крио-статных срезов. Поскольку в срезах ткани содержатся лишь небольшие количества воды, достаточным оказывается высушивание в небольших эксикаторах, помещенных в криостат. Температура при этом должна по возможности поддерживаться ниже — 18° С. Продолжительность сушки значительно меньше, чем для кусочков ткани.

2. Методы гистохимии 17

Для срезов толщиной 10 мкм она составляет от 45 мин до 1 ч. Срезы можно после этого расправить на стекле или фиксировать по Винклеру, расправляя их на предметном стекле в капле фиксирующего раствора (изопропиловый спирт, этанол).

При исследовании отдельных клеток или клеточных культур, выращиваемых в виде монослоя, рекомендуется высушивать их на воздухе, поскольку после замораживания—высушивания таких препаратов некоторые вещества, особенно ферменты, могут полностью диффундировать в среду. Чтобы избежать потерь ферментативной активности, монослои клеток следует защитить от доступа влаги и воздуха парафиновой пленкой (парафильм) и хранить при — 30° С. При рассмотрении структуры ткани следует учитывать возможные артефакты, обусловленные техникой получения срезов в криостате.

2.1.1.5. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ— ВЫСУШИВАНИЯ

Метод замораживания—высушивания оказался весьма ценным при подготовке тканей для гистохимических исследований. Его применение имеет преимущества в тех случаях, когда необходимо наряду с точной локализацией сохранить тонкую структуру и предотвратить потери веществ, присутствующих в ткани в низких концентрациях. Помимо уже упомянутых возможностей применения этого метода в исследованиях низкомолекулярных органических 1Гнеорганических веществ, следует отметить радиоавтографические исследования, цитофотометрию в видимом и ультрафиолетовом свете, рентгеновскую гистоспектро-графию и, наконец, электронную микроскопию.

Заметные успехи были достигнуты с помощью замораживания—высушивания в изучении локализации биогенных аминов в нервной системе. Выявление даже незначительных количеств биогенных аминов в тончайших волокнах оказалось возможным в первую очередь благодаря медленному, щадящему высушиванию. Несомненно, что гистохимическое выявление биогенных аминов, основанное на применении замораживания—высушивания,

18 2. Методы гистохимии

обусловило значительный прогресс в изучении нервной системы.

2.1.1.6. АППАРАТУРА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—ВЫСУШИВАНИЯ

Аппараты, используемые для сушки тканей, должны обладать двумя важными качествами:

1) они должны обладать способностью работать при очень низких температурах (вплоть до — 66° С),

Рис. 2. Схема аппарата для замораживания—высушивания.

1—форвакуумный насос, 2—диффузионный насос, 3—вакуумметр, 4—сушильная установка. 5—охлаждающий палец, 6—сосуд с парафином, 7—термос для охлаждающей смеси.

2) задерживать при низких температурах лишь незначительные остатки влаги.

Этим они отличаются от промышленной аппаратуры для лиофильной сушки.

Установка для лиофильной сушки, используемая в гистологии и гистохимии, состоит из следующих частей:

2. Методы гистохимии 19

1) герметичная емкость для сушки с регулировкой температуры ткани,

2) приспособление для удаления сублимированных из ткани паров воды.

Удаление паров воды может проводиться с помощью вакуумного насоса с вымораживанием или поглощением паров воды.

Простейшим аппаратом для лиофильной сушки является эксикатор с внешним охлаждением. Дальнейшие усовершенствования касаются главным образом технической стороны, в частности удаления паров воды. Схема аппарата для лиофильной сушки представлена на рис. 2,

Из современных аппаратов следует упомянуть аппарат для замораживания—высушивания с холодильной ловушкой и термоэлектрический аппарат для лиофильной сушки, сконструированный Пирсом (Реагсе). В последнем аппарате молекулы воды, улетучивающиеся из препарата, получают дополнительную энергию в располагающейся над объектом тепловой зоне. Поток водяных паров улавливается ловушкой с Р205 на дне камеры.

Установку для лиофильной сушки (выпускаемую в ГДР Народным предприятием "Labortechnik Ihnenau"), в которой пары воды удаляют путем прямой откачки, можно рекомендовать особенно в условиях замедленной сушки, необходимой, в частности, для сохранения структуры тончайших нервных волокон при выявлении биогенных аминов.

2.1.1.7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРОВЕДЕНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ— ВЫСУШИВАНИЯ

Процедура замораживания—высушивания проб тканей включает в себя следующие этапы:

1. Быстро иссеченные пробы ткани нарезают с помощью острого лезвия на кусочки толщиной 1—2 мм и помещают на алюминиевую фольгу (можно и на специально приготовленные чашечки).

2. Затем кусочки погружают в охлажденный жидким азотом изопентан или пропан.

3. После непродолжительного замораживания ткань

20 2. Методы гистохимии

помещают в камеру для сушки, предварительно охлажденную до - 50 - 80* С.

4. Сушку ткани проводят в течение нескольких дней в условиях высокого вакуума, поддерживаемого при помощи диффузионных и ротационных насосов.

5. Ткань заливают в вакууме при постепенном подогревании парафина.

При проведении сушки на установке "Labortechnik II-menau" рекомендуется в камеру для сушки через специальное отверстие вставить на шлифе охлаждающий палец, достигающий расположенного на дне камеры сосуда с замерзшим парафином.

Материал, замороженный в изопентане, быстро помещают на парафин, находящийся на дне камеры для сушки. Камеру для сушки предварительно охлаждают до — 50° С и вводят в нее заполненный жидким азотом охлаждающий палец. После этого установку можно запускать в действие, начав с включения форвакуумного навеса. По достижении вакуума 0,1 мм рт. ст., включают масляный диффузионный насос.

При вакууме, превышающем 10~ 3 мм рт. ст., и при наличии жидкого азота в охлаждающем пальце первая фаза сушки длится от 8 до 10 ч. Вторая фаза сушки (также длительностью от 8 до 10 ч) начинается с того, что охлаждающий палец при отключенной вакуумной системе замещают пробкой со шлифом соответствующего диаметра и медленно впускают в систему сухой воздух через сосуд с силикагелем. После этого вновь включают форвакуумный, а затем и масляный диффузионный насос.

Основное высушивание считается законченным, когда показания вакуумметра в резервном сосуде форвакуумного насоса соответствуют максимальной величине, достигаемой с помощью форвакуумного насоса в начале сушки. В фазе заключительного высушивания температура высушиваемой ткани при сохранении вакуума доводится до комнатной. Для этого удаляют охлаждающую жидкость, окружающую камеру. Заключительное высушивание длится около 2 ч.

Пропитка и заливка в парафин проводится еще в вакууме, после чего масляный диффузионный насос отключают. Парафин расплавляют нагреванием, например, в горячей

2. Методы гистохимии 21

Таблица 1

Технические данные установки для лиофильной сушки ("Labortechnik

Достигаемый вакуум Ю-5 мм рт. ст.

Скорость откачки при 10 3 мм рт. ст. ~ 100 м3/ч

Требуемый вакуум для масляного диффузионного ОД мм рт. ст.

насоса Продолжительность высушивания 0,1 г ткани:

Основное высушивание при температурах

до -35°С 5-10ч

от -45 до -50°С 20-30ч

- -60 С 30- 50ч

Заключительное высушивание 1-2ч

воде. Ткань сравнительно быстро погружают в парафин. По достижении кусочком ткани дна сосуда с парафином вакуумный насос отключают и в систему запускают воздух. Через 10—15 мин ткань заливают, как обычно, в блок. Можно поступить иначе: высушенную ткань, быстро вынув из камеры, перенести в термостат с парафином, при этом пропитку парафином следует проводить несколько дольше.

2.12. ЗАМЕЩЕНИЕ В ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ

Согласно этому методу, предварительно замороженный материал помешают в охлажденную до температуры от — 20 до — 50" С (или ниже) фиксирующую или обезвоживающую жидкость, например этанол, метанол, эфир, хлороформ, ацетон, смесь ацетона с этанолом или гликоль; В результате двусторонней диффузии происходит замещение превращенной в лед воды на замещающую жидкость. Замещающие жидкости служат при этом средами, растворяющими лед. Замещение воды ткани растворителем занимает несколько дней. Поскольку замещение проводится в безводных средах, то происходит обезвоживание или высушивание ткани. Этот процесс проходит до конца лишь в случае повторной замены охлажденной замещающей жидкости.

Принципиальные возможности использования метода замещения в замороженном состоянии зависят от выби-

22 2. Методы гистохимии

раемого для замещения раствора. Возможны три варианта: /

1) использование полярного растворителя, например этанола,

2) использование раствора, содержащего фиксирующее средство,

3) замещение в замороженном состоянии на полярный растворитель с фиксацией при низких температурах.

Сведения о дальнейших возможностях использования варианта 3 представлены в табл. 2.

Как только кусочек ткани пропитается замещающей жидкостью (через 3 — 4 дня), процесс можно считать законченным. Продо