Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

3.4.1. Р-ГЛЮКУРОНИДАЗА (КФ 3.2.1.31)

Этот фермент катализирует гидролиз природных и синтетических P-D-глюкуронидов:

—С

^CHO-R + Н80 * \(3H0H + ROH

200 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Согласно классификации ферментов (КФ), Р-глюкуронида-зу относят к лизосомным ферментам, хотя Фишману и сотр. (Fishman u. Mitarb.) удалось выявить этот фермент и в эндоплазматическом ретикулуме. При световой микроскопии для гистохимического выявления этого фермента используют хорошо зарекомендовавший себя метод одновременного сочетания по Хайяси (Hayashi) с нафтол-AS-Ш-глюкуронидом в качестве субстрата и с гексазоний-парарозанилином в качестве сочетающего реагента. Близкие результаты позволяет получать индигогенньш метод с использованием в качестве субстрата 4-хлор-5-бром-3-индоксил-Р-Е>-глюкуронида, а в качестве окисляющего агента феррицианида калия (Lo-jda, 1971).

Для ультрагистохимического выявления активности (3-глюкуронидазы в цитоплазме, несмотря на недостатки в отношении точности локализации, пригоден метод последующего сочетания по Смиту и Фишману (Smith, Fish-man, 1963). Необходимая электронная плотность достигается при этом благодаря использованию диазотирован-ного л-{ацетоксимеркури)-анилина. Этот так называемый АМА-диазотат, по-видимому, более пригоден в качестве сочетающего реагента, чем гексазоний-парарозанилин.

4.5.3.4.2. Р-ГАЛАКТОЗИДАЗА (КФ 3.2.1.23)

Этот широко распространенный в животных тканях фермент расщепляет различные Р-галактозиды, включая лактозу, но не Р-глюкозиды. рН-Оптимум фермента лежит в пределах 3—4,5 и зависит от вида животного, исследуемого органа, применявшегося субстрата и буфера. В качестве ингибиторов известны галактонолактон и и-хлормер-курибензоат. Согласно данным, полученным с использованием метода дифференциального центрифугирования, активность этого фермента связана с лизосомной фракцией. Этот фермент участвует в катаболизме мукоидных веществ и гликолипидов.

В кишечнике и почках была выявлена еще одна Р-галак-тозидаза с более высоким рН-оптимумом и более прочной связью со структурами, которая известна как нейтральная

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 201

Р-галактдоидаза, или лактаза. Ее физиологическая роль состоит в расщеплении лактозы пищи.

Для гистохимического выявления р-галактозидазной активности в качестве субстрата используют лактозу и синтетические галактоз иды. Однако методы, в которых используются эти субстраты, не позволяют получать удовлетворительных результатов. Особенно с синтетическими галактозидами нельзя добиться ни разделения двух типов р-галактозидазы, ни четкой лизосомной локализации. Все эти трудности устраняются, если в качестве субстрата использовать 5-бром-4-хлор-3-индоксил-Р-0-г алактозид для кислой р-галактозидазы и 5-бром-4-хлор-3-индоксил-рЧЭ-фукозид—для нейтральной; для инкубационной среды при этом рекомендуется цитратно-фосфатный буфер, а в качестве окисляющего агента—феррицианид калия (Lo-jda, 1970). Выявленная при таких условиях локализация обеих Р-галактозидаз in situ хорошо согласуется с биохимическими данными.

Для электронно-гистохимической локализации Р-галактозидазы можно использовать реакцию образования коричневого пигмента Хэтчетта (результат связывания восстановленного феррицианида с Си2+).

4.53.5. ПгШТИДАЗЫ

Будучи протеол и гическими ферментами, пептид азы расщепляют ( — СО — NH — )-связи. Эти ферменты делятся иа две основные группы:

1. Экзопептидазы, которые расщепляют только концевые пептидные связи.

2. Эндопептидазы, или протеиназы, расщепляющие пептидные связи, находящиеся внутри полипептидной цепи.

В обеих группах встречаются ферменты, действующие как вне-, так и внутриклеточно; их рН-оптимум лежит в пределах 4—6. Правда, описаны также ферменты с оптимумом при рН 3 и при рН 11. Группу внутриклеточных кислых пептид аз объединяют под термином «катепсины» с порядковыми буквенными обозначениями от А до Е. К эндопептидазам относятся катепсины В, D и Е, к зжзо-пептидазам—катепсины А и С. Катепсины А, В, С и D ло-

202 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

кализуются в лизосомах. Пептидазная активность была выявлена в клетках проксимального отдела извитых канальцев почек в мембранах гладкого энодоплазматическо-го ретикулума и в пузырьках Гольджи в области щеточной каемки. В остальном из-за недостаточной надежности ультрагистохимических методов корреляция между субклеточными структ} :>ами и активностью ферментов этой группы точно неустановлена.

Как в световой, так и в электронной микроскопии, гистохимическое выявление касается главным образом ами-нопептидаз, относящихся к экзопептидазам. В световой микроскопии для локализации экзопептидаз мы располагаем практически лишь методом с протеинатом серебра по Ямаде и Офуги (Yamada, Ofugi, 1968), механизм реакции при котором пока еще не выяснен.

Выявление аминопептидаз основано на принципе одновременного азосочетания. При световой микроскопии выявление основано на отщеплении соединения нафтола от субстрата в результате действия фермента. При одновременном сочетании этого соединения с солью диазония образуется нерастворимый азокраситель. Из применяемых субстратов следует выделить Ь-лейцил-4-метокси-2-нафти-ламид или Ь-аланил-4-мето. си-2-нафтиламид, обладающие высокой скоростью сочетания. Правда, на локализацию красителя в месте нахождения фермента влияет также поведение используемых солей диазония по отношению к липидам:

В световой микроскопии для выявления аминопепти-дазной активности пригодны методы с Ь-лейцил-(3-нафти-л амидом или Ь-лейцил-4-метокси-р-нафталамидом. В электронной гистохимии выявление этого фермента возможно с помощью реакции образования азокрасителя по Зелигману и др. (Seligman et аЦ 1970).

4.5.3.6. ФОСФОРИЛАЗЫ

Фосфорилазы катализируют следующую реакцию без захвата или отдачи молекулы воды:

Глюкозо-1-фосфат <± Полисахарид + Н3Р04.

Из рассмотрения механизма этой реакции следует, что

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 203

участвующие в ней ферменты ответственны как за распад, так и за синтез гликогена. Однако предполагается, что фосфорилазы в тканях ответственны главным образом за процесс распада гликогена, за счет укорочения глюкозной цепи. Находящаяся в тканях неактивная фосфорилаза (фосфорилаза В) переводится под действием киназы в активную форму (фосфорилаза А) в присутствии Mg2+; при этом расходуется АТФ.

2 Фосфорилаза В + 4 АТФ -> Фосфорилаза А + 4 АДФ.

В синтезе гликогена с неразветвленной цепью и гликогена с разветвленной цепью участвуют разные ферменты. В построении неразветвленных полисахаридов принимает участие так называемая амилофосфорилаза (а-глюкозил-трансфераза, КФ 2.4.1.1), или Р-фермент. Синтез разветвленных полисахаридов, наоборот, катализируется другим ферментом. Этот так называемый ветвящий фермент, или Q-фермент, катализирует образование 1-»6-связей в местах ветвления полисахаридной цепи. Он называется а-глюкантрансферазой (КФ 2.4.1.18), или 1,4-ос-глюкан-ветвя-щим ферментом.

Для гистохимии, кроме того, представляет интерес УДФ-глюкоза—гликогенглюкозилтрансфераза (КФ 2.4.1.11)—фермент, который участвует в синтезе гликогена из уридиндифосфоглюкозы. Поскольку этот фермент катализирует синтез гликогена, его называют также гликоген-синтазой (Luppa, Bernstein, 1977).

Гистохимическое выявление трех биохимически охарактеризованных гликозилтрансфераз основано на визуализации синтезированного полисахарида. Таким образом, речь идет о прямом выявлении естественного продукта реакции. Для демонстрации продукта реакции имеются два основных метода: йодная реакция и ШИК-реакция. Можно рекомендовать гистохимическую реакцию с иодом, разработанную Такеучи и Куриаки (Takeuchi, Kuriaki, 1955). Принцип этой реакции заключается в выявлении новообразованного полисахарида типа амилозы. При этом проводят инкубацию в растворе, содержащем в качестве субстрата глюкозо-1-фосфат, в качестве активаторов—ад-енозин-5-фосфат и инсулин, а также гликоген для затравки. Возможность осаждения высвобождающегося неорга-

204 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

нического фосфата по принципу Гомори при помощи ионов свинца представляет скорее теоретический, нежели практический интерес, поскольку ионы свинца сильно подавляют фосфорилазную активность (Pearse, 1972). Между тем разработаны реакции, позволяющие осуществлять точную ультраструктурную локализацию фосфорилазы и УДФ-глюкоза—гликогенглюкозилтрансферазы без использования ионов свинца в качестве осаждающего агента (Takeuchi, Sasahi, 1970).

При световой микроскопии для выявления фосфори-лазной активности, как правило, отдается предпочтение йодной реакции, поскольку в отличие от ШИК-реакции с ее помощью удается отличать новообразованный гликоген от нативного или эндогенного. Зассе (Sasse, 1966) использует для этого гидролиз 10%-ной серной кислотой.

Бели в световой микроскопии надежная дифференцировка нативного гликогена от новообразованного возможна лишь с помощью удаления нативного гликогена после проведения реакции, то на ультраструктурном уровне эта задача разрешается на основе различий в морфологии обоих типов гликогена (Geyer, 1973). Нельзя не отметить, однако, что установление таких различий между нативным гликогеном и новообразованной полиглюкозой сопряжено с определенными трудностями.

Фосфорилазная активность в тканях, в которых содержание нативного гликогена сильно снижено (вплоть до полного отсутствия) в результате экспериментальных воздействий или патологических процессов, может быть выявлена методом с использованием декстрана в качестве естественного акцептора для гликозильных остатков (Mei-jer, 1968). Этот метод считается в настоящее время предпочтительным.

Различия между фосфорилазой и ветвящим ферментом могут быть установлены с помощью вспомогательных процедур, перечисленных в табл. 41.

4.5.4. ТРАНСФЕРАЗЫ

К трансферазам принадлежат ферменты, катализирующие перенос групп (например, фосфатных, карбоксильных, ацильных). Набор надежных гистохимических методов вы-

4. Гистохим

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.02.2020)