ия отдельных классов веществ и ферментов 205

Таблица 41

Различия между фосфорнлазой ¦ ветвшцнм ферментом (Kiszely, Р6-zalaky)

Фосфорилаза Ветвящий фермент

Реакции Синтезированный полисахарид

Амилоза типа А Амилопектин-гликоген

Иод ШИК а-Амилаза Р-Амилаза Этанол (20%) Меркурихлорид (10-t М) Голубое окрашивание Положительна Полное расщепление То же Слабое подавление То же Фиолетово-красное, коричневато-пурпурное Положительна Полное расщепление Расщепления нет Сильное подавление Полное подавление

явления трансферам в настоящее время невелик. На уровне световой и электронной микроскопии могут быть выявлены следующие ферменты: аспартат—карбамоилтранс-фераза (КФ 2vl.3.2; выявляется лишь при электронной микроскопии), орнитин — карбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3), холин-ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.6), аспартатамино-трансфераза (КФ 2.6.1.1; ранее известна как глутамат-оксалацетат — трансаминаза, или ГОТ), орнитин-оксокислота — аминотрансфераза (КФ 2.6.1.13), гексокиназа (КФ 2.7.1.1; выявляется при световой микроскопии), глюкокиназа (КФ 2.7.1.2; световая микроскопия), креатинкиназа (КФ 2.7.3.2), фосфоглюкомутаза (КФ 2.7.5.1; световая микроскопия), у-глутамилтрансфераза (КФ 2.3.2.2).

4.5.4.1. ХОЛ11Н-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (КФ 2.3.1.6)

Этот фермент в противоположность ацетилхолинзсте-разе принимает участие в синтезе нейромедиатора ацетилхолина. В его задачу входит перенос ацетильной группы от ацетил-КоА на холин.

Предполагается, что холин-ацетилтрансфераза встречается в нескольких молекулярных формах, или конфигурациях. Она является растворимым цитоплазматическим ферментом, активность и растворимость которого зависят от ионной силы. Как показали исследования, этот фермент

206 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Таблица 42

Область мозга Сохранность гнстохямичсски выявляемой активности холин-ацетилтрансферазы в криостат-ных срезах в процентах по отношению к общей активности (радиохимические измерения) Спинной мозг 43-44

Неостриатум (хвостатое тело, скор- 26-27

лупа) и лобная кора

Область ядер гипоталамуса 39-74

обладает различной растворимостью в различных участках мозга (табл. 42).

Создание надежного гистохимического метода локализации холин-трансферазы диктуется необходимостью локализации синтеза ацетилхолина in situ, поскольку прямое топохимическое выявление нейромедиатора ацетилхолина в настоящее время методически невозможно.

Берт (Burt) и Каза (Kasa) разработали методы гистохимического выявления этого фермента на основе одинакового принципа: SH-группа, высвобождаемая из ацетил-КоА в процессе образования ацетилхолина, осаждается с помощью ионов тяжелых металлов, например свинца. Однако практически любой ферменту действие которого в условиях данной инкубационной среды направлено на высвобождение кофермента А, может давать положительную реакцию. Поэтому зависимость реакции от холина является необходимым критерием специфичности. Невыясненным остается вопрос, является ли содержание эндогенного холина достаточным для прохождения гистохимической реакции.

Однако наибольшим недостатком этого метода является то, что для холин-ацетилтрансферазы нет специфического необратимого ингибитора, который бы мог быть использован в гистохимических условиях. На основании радиохимических сравнительных исследований Берт приходит к выводу, что 70% выявляемого с помощью его метода продукта реакции может быть отнесено за счет хо-лин-ацетилтрансферазной активности. Каза полагает, что с помощью его метода, который отличается от метода Берта концентрацией ионов свинца, ацетил-КоА, холина и буфера, удается выявлять вплоть до 90% ферментативной активности. Модификация этого метода с использова-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 207

нием полупроницаемых мембран позволяет снижать потери ферментативной активности в результате вымывания. Добавление NaCl в инкубационную среду в качестве активатора позволяет еще более повысить специфичность этого метода (Hiither, Luppa).

4.5.5. КАРБОАНГИДРАЗА (КФ 4.2.1.1)

Цинксодержащий фермент карбоангидраза катализирует следующую реакцию:

Карбоангидраза «

н2со31 * го. + н2о.

Значительно повышая скорость этой реакции, карбоангидраза играет важную роль в целом ряде процессов, протекающих в организме.

Как показывают биохимические данные, этот фермент не относится к категории повсеместных: он встречается лишь в некоторых органах, например в жабрах у рыб, слюнных железах, эритроцитах, почках, слизистой желудка, поджелудочной железе, центральной нервной системе, цилиарном теле глаза у млекопитающих. Этот факт подчеркивает значение топохимического выявления карбоан-гидразы.

Основное условие гистохимического выявления этого фермента заключается в том, что в процессе гистохимической реакции срезы ткани должны находиться на поверхности инкубационного раствора, что обеспечивает беспрепятственное выделение С02.

После того как выяснилось, что применявшийся с 1953 г. метод Кураты (Kurata) не обладает специфичностью, для выявления карбонагидразы как в световой, так и в электронной микроскопии стали применять методы Хаузлера (Hausler, 1958) и Ханссона (Hansson, 1967), а также их модификации. Согласно Хаузлеру, ферментативная реакция имеет следующий механизм:

2 НС03- *±С032-+ Н2С03

Карбоигидраза

Н2С03^==^:н20 + С02. С03~ осаждается ионами Со2+ из среды в виде СоС03.

208 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Ханссон, наоборот, видит предпосылку для осуществления этой реакции в обогащении среды ионами ОН". При этом в месте локализации фермента должен выпадать в осадок гидроксид кобальта или основной карбонат кальция.

¦

СО3 + Н+ 5=± HCQf + Н+ 5=Ь Н2С0з 5=± • С02 + Н2О

+ +

ОН" ОН"

. \\ U

Н20 Н20

Ферментативная активность при выявлении ее с помощью этих двух методов ингибируется ацетаз ол амид ом, которым лучше обрабатывать срезы до инкубации. Чувствительность к.ацетазоламиду считается важным критерием специфичности данной реакции*. Особенно наглядно результаты этой реакции можно наблюдать, используя такие объекты, как обкладочные клетки и эритроциты.

По мнению Мазера (Muther, 1972), методы выявления карбоангидразы лишены необходимой*специфичности по следующей причине: продукт реакции образуется в виде неизвестного соединения кобальта под влиянием не зависящего от действия фермента защелачивания среды. Ингибиторы карбоангидразы подавляют окрашивание через промежуточную реакцию с кобальтом, а не в результате подавления самого фермента. На эту реакцию могут оказывать влияние агенты, не относящиеся к ингибиторам карбоангидразы (например, лаурилсульфат натрия, 5-ами-нотиодиазол).

Согласно Мазеру, данные методы в принципе выявляют активность карбоангидразы, однако механизм реакции, по его мнению, отличается от механизмов, предложенных авторами этих методов.

4.5.6. ОКСНДОРЕДУКТАЗЫ

Ферменты этой группы ответственны за высвобождение необходимой организму энергии из питательных ве-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 209

ществ в процессе окисления. Согласно механизму высвобождения энергии, различают дегидрогеназы и окси-дазы.

4.5.6.1. ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Дегидрогеназами называют ферменты, которые отщепляют водород от соответствующего субстрата и переносят его на акцептор.

Этот механизм действия используется в гистохимических методах, при которых в систему вводится индикатор, принимающий на себя водород. Индикатор должен при этом менять окраску и выпадать в осадок. В качестве индикаторов ранее применяли теллурит натрия и калия, а также селенит натрия. Кроме того, используется эффект обесцвечивания метиленового синего под влиянием воздействия дегидрогеназ. Однако эра гистохимии дегидрогеназ началась лишь с того момента, как в практику вошли соли тетразолия.

Использование водорастворимых солей тетразолия основано на том, что под действием восстанавливающих веществ они превращаются в водонерастворимый окрашенный формазан. В гистохимических реакциях соли тетразолия выступают в роли акцепторов водорода, что легко показать на примере восстановления часто приме-нявшегося ранее трифенолтеТразолийхлорида (ТТХ) до имеющего красный цвет формазана:

Постепенно на смену ТТХ пришел целый ряд новых солей тетразолия, более пригодных для микроскопических исследований. К ним принадлежат: неотетразолийхлорид (НТ), синий тетразолий (СТ, тетразолиевый синий), 3-{4,5-диметилтаазолил-2)-2,5-дифинш1тетразолийбромид (МТТ), иоднитрофенилтетразолий (ИНТ), нитро-СТ и те-гранитро-СТ (ТНСТ).

+НС1

сг

Соль тетразолия (бесцветная)

Формазан (окрашенный)

210 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Пригодность солей тетразолия определяется их особыми свойствами. Будучи акцепторами водорода (электронов), они должны принимать на себя водород, который, проходя через всю систему переносчиков, соединяется с молекулярным кислородом. Соответственно окислительно-восстановительный потенциал (окисляющая способность) различных солей тетразолия является важным критерием их гистохимической пригодности.

Помимо окислительно-восстановительного потенциала солей тетразолия для гистохимического выявления дегидрогеназ важное значение имеют свойства формазанов; к ним относятся: а) тонкая структура, б) субстактивность, в) растворимость.

Локализация фермента в клетке возможна лишь тогда, когда используемые соли тетразолия образуют аморфный или хотя бы микрокристаллический формазан. Посредством связывания в комплекс солями металлов в процессе инкубации можно предотвратить растворение кристаллов формазана, как это и делается при использовании МТТ-ко-бальтового метода.

Формазаны должны обладать также определенной суб-стантивностью, т. е. способностью связываться с белками. При этом не должно происходить вторичной адсорбции на других компонентах ткани.

Формазаны нерастворимы в воде, но имеют тенденцию растворяться в липидах. Такими нежелательными свойствами обладали применявшиеся прежде препараты тетразолия (например, ТГС). Нитро-СТ и особенно тетранитро-СТ о