Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

бладают низкой растворимостью в липидах или же вовсе не растворяются в них. Согласно многочисленным исследованиям, формазаны, полученные при использовании МТТ, нитро-СТ и тетранитро-СТ, позволяют устанавливать внутриклеточную локализацию дегидрогеназ под световым микроскопом.

Для электронно-микроскопического выявления дегидрогеназ подходящими реагентами оказались нитро-СТ и тетранитро-СТ, с осмиофильной тиокарбамильной группой (ТК-НСТ). Для этих целей можно также использовать тетранитро-СТ. Правда, следует учитывать возможное вымывание формазана в процессе заливки.

Кроме того, для выявления различных дегидрогеназ

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 211

и диафораз используется феррицианид, способный принимать на себя электроны с дыхательной цепи, восстанавливаясь до ферроцианида. В присутствии Си2+ ферроцианид образует электроноплотный мелкозернистый ферроцианид меди.

Выявление НАД + - и НАДФ + -зависимых дегидрогеназ проходит в два этапа (I и II):

Субстрат НАп+ Формазан (восстановленный^ '

Субстрат, ' >НАДН/ Нит^с1 (окисленный} hawh

Ферментативное окисление субстрата сопровождается образованием НАДН или НАДФН (/). На втором этапе реакции (II) соль тетразолия в сопряженной «индикаторной реакции» восстанавливается до формазана при участии диафоразы. При этом НАДН или НАДФН снова окисляются. Образование формазана, таким образом, происходит в месте действия диафоразы, как правило в митохондриях.

4.5.6.1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕНАЗИНМЕТОСУЛЬФАТА И СРЕД С ГЕЛЬ-ОБРАЗУЮЩИМ ПОЛИВИНИЛОВЫМ СПИРТОМ (ГЕЛЬ-ПВС)

1. ФЕНАЗИНМЕЮСУЛЬФАТ

Светочувствительный феназинметосульфат может при выявлении дегидрогеназ заменять липопротеидный комплекс фермента. Будучи неферментативным переносчиком водорода, он способен переносить водород непосредственно от кофермента на индикатор (схема на стр. 213). Благодаря этому цветную реакцию (образование формазана) коферментзависимых дегидрогеназ можно проводить без участия диафоразы. Важно, что благодаря феназинмето-сульфату нитро-СТ сохраняет свою способность связывания со структурами (субстантивность).

Добавление к инкубационной среде феназинметосуль-

212 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

фата (0,08 мг/мл) ослабляет, но не устраняет полностью потери растворимых дегидрогеназ. При этом следует также учитывать возможность смещения ферментов.

2. СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕЛЬ-ПВС

Среды с гель-ПВС используются при выявлении растворимых НАД-зависимых дегидрогеназ, поскольку добавление ПВС к инкубационной среде в значительной мере, хотя и неполностью, предотвращает диффузию ферментов. Еще успешнее проблема диффузии решается путем использования полупроницаемых мембран (описано далее).

4.5.6.1.2. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ И ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ

Правильная оценка интенсивности гистохимической реакции на дегидрогеназную активность возможна лишь при линейной зависимости между ферментативной активностью в срезе и количеством продукта реакции. При этих условиях фиксация является нежелательной, поскольку она всегда ведет к частичной инактивации фермента. Если определение дегидрогеназной активности предпринимается при изучении обменных процессов, то следует избегать фиксации как на Целой ткани, так и на срезах. Препарат рекомендуется фиксировать 10%-ным формалином после инкубации (постфиксация).

4.5.6.1.3. БЕССУБСТРАТНАЯ ДЕГИДРОГЕНАЗА

Под реакцией бессубстратной дегидрогеназы понимают образование формазана, которое может проходить в среде, содержащей НАД, в отсутствие субстрата и усиливается при подщелачивании среды. Повышение концентрации НАД также увеличивает эффект. Вещества, блокирующие сульфгидрильные группы, полностью подавляют активность «бессубстратной (nothing-) дегидрогеназы», Чтобы избежать реакции, не зависящей от активности выявляемого фермента, следует придерживаться нейтральных

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 213

величин рН (7,0—7,2), а подходящую концентрацию НАД определять в предварительных опытах с серией различных концентраций без добавки субстрата. Реакция «бессубстратной дегидрогеназы» бывает частично обусловлена ферментативной активностью.

4.5.6.1.4. ГИСТОХИМИЯ НЕКОТОРЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ

1. СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА — СУКЦИНАТ (АКЦЕПТОР) ОКСИДОРЕДУКТАЗ А; КФ 1.3.99.1

Этот фермент, обладающий высокой субстратной специфичностью, катализирует в цикле Кребса окисление янтарной кислоты до фумаровой:

СООН - СН2 - СН2 - СООН ?± СООН -СН = СНСООН.

Сукцинатдегидрогеназа является SH-содержащим ферментом, прочно связанным с митохондриями (митохон-дриальный «маркерный» фермент). Поскольку он принадлежит к флавопротеидам, то обладает способностью переносить электроны без участия пиридиннуклеотидов.

Сух цинаш

Л 2Н ----^цит.6-—*-цит.с-"—цит. аГа}Р—-*-0г

Фумарат дегидро- <р?назин - метосцль тат геназа г

Добавление феназинметосульфата к инкубационной среде усиливает реакцию. 0,05 М малонат ведет к избирательному подавлению сукцинатдегидрогеназной активности. При точном соблюдении условий реакции количество продукта реакции линейно зависит от ферментативной активности. Этот факт подчеркивает важность гистохимического выявления сукцинатдегидрогеназы.

2. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА (L-ЛАКТАТ: НАД*— ОКСИДОРЕДУКТАЗА; КФ 1.1.1.27)

Этот принадлежащий к гликолитической системе рае-

214 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

творимый фермент катализирует окисление лактата до пирувата:

сн3 сн3 снон + над с=0 + надн2 соон соон Лакают Пируват

Лактатдегидрогеназа встречается в различных молекулярных формах. В органах млекопитающих она представлена пятью изоферментами, каждый из которых построен из 4 мономеров. Поскольку эти 5 изофер-ментов различаются по своим биохимическим и физическим характеристикам, их можно разделять на срезах. Для дифференцирования изоферментов было предложено 3 метода:

а) изменение концентраций субстрата для определения двух типов мономеров (А и В-мономеры); б) предварительная инкубация с мочевиной; в) подавление сульфитом.

С помощью этих методов удалось установить колебания в распределении изоферментов лактатдегидрогеназы в печени. Использование полупроницаемых мембран позволило ограничить диффузию лактатдегидрогеназы в инкубационную среду, так что для изучения проблем метаболизма гистохимический подход стал ныне более пригодным, чем биохимический.

3. ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ—ДЕГИДРОГЕНАЗА (ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ: НАДФ+ — ОКСИДОРЕДЖТАЗА; КФ 1.1.1.49)

Этот растворимый НАДФ-зависимый фермент, будучи первым в пентозофосфатном цикле, катализирует в присутствии НАДФ следующую реакцию:

Глюкозо-6-фосфат + Н АДФ +± 6-фосфоглюконовая кислота-8-лактон + НАДФН + Н +

В процессе промежуточного обмена этот фермент участвует не столько в выработке энергии, сколько в синтезе

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 215

специфических предшественников РНК (например, рибозы) и в регенерации восстановленного НАДФ (НАДФН). Топохимическое выявление фермента позволяет устанавливать места, где протекает пентозофосфатный цикл.

4.5.6.2. ОКСИДАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ

Оксидазы переносят водород от субстрата на кислород, восстанавливая его до воды.

Пероксидазы катализируют окисление субстрата с помощью перекиси водорода:

Пероксидаза + Н202 -> Пероксидаза-Н202, Субстрат-Н2 + Пероксидаза-Н202 -> Окисленный субстрат + Пероксидаза + 2Н20.

4.'5.6.2.1. ЦИТОХРОМОКСИДАЗА (КФ 1.9.3.1)

Фермент катализирует перенос электронов с цитохрома с на кислород. Он представляет собой железосодержащую истинную аэробную оксид азу, которая встречается практически во всех клетках, за исключением эритроцитов и анаэробных бактерий. Этот фермент нерастворим и прочно связан с митохондриями. Его действие зависит от обратимого окисления и восстановления кофактора железа. При этом электроны водорода переносятся на молекулярный кислород. В этом процессе образуется вода:

Fe3+ ^Fe2* Субстрат • Н2 + i 02 Субстрат + Н20. (Цитохром)

Гистохимическое выявление цитохромоксидазы основано на наблюдении Эрлиха, который заметил, что при взаимодействии растворов а-нафтолов и диметил-и-фени-лендиамина (сокращенно—НАДИ) с тканями животных

216 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

образуются гранулы индофенолового синего:

н3с сн3

HjC сн3

N ОН

+ 02 —*• N + 2Н20

еС-

Диметил-п-(рениленвиамин

Индоатеноловыи синий

На основании тщательных исследований было установлено, что индофеноловый синий образуется под действием цитохромоксидазы и что фермент, который ранее называли индофенолоксидазой, идентичен цитохромоксидазе. Ценность НАДИ -реакции несколько снижается из-за слабой сохранности продукта реакции (индофенолового синего) и его склонностью растворяться в липидах.

Успешному выявлению цитохромоксидазы при световой микроскопии сильно способствовали исследования Бёрстоуна (Burstone). В предложенном им методе образуется стабильный продукт реакции. Из большого числа апробированных аминов наиболее подходящим субстратом оказался N-фенил-и-фенилендиамин. В качестве сочетающего агента можно использовать целый ряд замещенных нафтолов, например 1-окс«-2-нафтойную кислоту. Стабильность продукта реакции повышается путем образования хелата с кобальтом.

он

/=\ Y /=\ ^Л^соон Окисленный

N - /ренил-п - феншген 1-окси-2- \ / \

диамин * нсщтойная \ \ цитохромоксидаза кислота \\ +0г

НООС

шепота \ \ 0 / \

Индофенол

Восстановленный цитохром

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 217

Для электронно-микроскопического выявления цитох-ромоксидазы пригодным оказался 3,3 -диаминобензидин (ДАБ). В системе НАДИ-реакции ДАБ дает осмиофильный продукт, который может быть переведен с помощью Os04 в черный электроноплотньгй, нерастворимый осадок (осмиевая чернь). Продукт реакции локализуется только в митохондриях.

4.5.6.2.2. МОНОАМИНОКСИДАЗА (КФ 1.4.3.4)

Моноаминоксидаза (МАО) катализирует окислительное дезаминирование моноаминов до альдегидов:

RCH2NH2 + 02 + Н20 ?± RCHO + Н202 + NH3.

Этот связанный со структурами и локализующийся в митохондриях

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.11.2019)