фермент легко реагирует с такими субстратами, как триптамин, 5-окситриптамин и тирамин. На распад норадреналина фермент влияет в меньшей степени. Моноаминоксидаза играет важную роль в процессах де-токсикации и в метаболизме аминов. Его функциональное значение выяснено еще не во всех деталях. В нервной системе активность МАО подавляют амфетамин и марсилид; она часто служит индикатором аминэргических структур.

В световой микроскопии гистохимическое выявление МАО основано на трех принципах:

а) выявление альдегидных групп, образующихся в результате окисления аминов; б) образование пигмента при окислительном распаде триптамина или 5-окситриптами-на; в) образование формазана в результате восстановления тетразолия в процессе окислительного дезаминирования аминнОго субстрата.

На последнем принципе основан метод Гленнера, Берт-нера и Брауна (Glenner, Burtner, Brown) с использованием триптамингидрохлорида в качестве субстрата и нитро-СТ в роли акцептора водорода. Этот метод оказался весьма эффективным, особенно для выявления МАО в центральной нервной системе. На основе этого метода было разработано несколько дальнейших модификаций.

Электронно-микроскопическое выявление фермента также основано на восстановлении солей тетразолия, из

218 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

которых наиболее подходящим оказался осмиофильный ТК-НФТ.

4.5.6.2.3. ПЕРОКСИДАЗА (КФ 1.11.1.7)

Различные пероксидазы образуют ферментную систему, основная задача которой—расщепление Н262 в клетках. Подобную функцию могут выполнять также цитох-ром-с-пероксидаза и каталаза. Каталаза и пероксидаза имеют сходный принцип действия. При высокой концентрации Н202 каталаза реагирует как каталаза, тогда как при низких концентрациях Н262 она действует как пероксидаза. В физиологических условиях почти всегда каталаза действует как пероксидаза.

Пероксидазы животных и растительных тканей различаются по геминовой группе. Растительная пероксидаза содержит в качестве простетической группы протогемин (Fe -протопорфирин—красный гемин); животные пероксидазы, или вердопероксидазы, наоборот, содержат зеленый гемин. Особую роль играет пероксидаза хрена: она используется в качестве метки антител, а также как маркерный фермент при изучении процессов транспорта и проницаемости в животных тканях. При этом очень подходящим оказался низкий молекулярный вес фермента (44 ООО).

Пероксидазы обладают способностью окислять различные ароматические амины и фенолы до окрашенных соединений. Именно на этом их свойстве основано в первую очередь их гистохимическое выявление. В гистохимии используют следующие методы:

а) метод с бензидином; б) щелочную НАДИ-реакцию; в) реакцию с а-нафтолом; г) методы с лейкокрасителями; д) метод с тиоиндоксидом; е) метод с ДАБ.

Особенно важную роль играет разработанный Грэхемом и Карновским (Graham, Karnowsky) метод с диамино-бензидином (ДАБ), в котором продукт окисления 3,3 -диа-минобензидина конденсируется в осмиофильный полимер. Этот метод используется главным образом для электронно-цитохимической идентификации пероксисом. Его можно использовать для тех же целей и в световой микроскопии.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 219

4.5.7. ВЫЯВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СУБСТРАТНОЙ ПЛЕНКИ И ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ МЕМБРАН

4.5.7.1. МЕТОД СУБСТРАТНОЙ ПЛЕНКИ

Разработанный Дау (Daoust) метод предполагает нанесение тонкой пленки с субстратом непосредственно на свежий срез ткани. После инкубации определенной продолжительности на пленке с субстратом благодаря гистохимическим реакциям или обычному окрашиванию возникают места просветления. Неокрашенные участки на пленке соответствуют локализации ферментативной активности в срезе ткани, находящемся в контакте с пленкой (рис. 4).

Этот в принципе простой метод требует определенных навыков, поэтому удовлетворительные результаты достигаются лишь после приобретения опыта работы. Кроме того, успех метода зависит от целого ряда условий: в частности, субстрат должен быть нерастворимым в воде и доступным для действия фермента.

До сих пор методом субстратной пленки изучали главным образом гидролитические ферменты, причем этот метод не позволяет делать выводов о локализации ферментативной активности на клеточном уровне. Наиболее известны методы выявления нуклеаз (ДНКаза и РНКаза) и протеаз. Кроме того, этот метод позволяет выявлять различные гликозидазы. Из группы оксидоредуктаз до сих пор этим методом выявляют только катал азы.

Весьма чувствительным методом выявления протеаз может служить метод окрашенной пленки (Frattello, 1968).

4.5.7.2. МЕТОД ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ МЕМБРАН

Этот метод был разработан главным образом с той целью, чтобы сделать растворимые ферменты доступными для гистохимического изучения. При этом отпадает необходимость в фиксации замороженных срезов, которая, ослабляя диффузию фермента, неизбежно ведет к его частичной инактивации. Данный метод не только ослабляет диффузию фермента в среду с субстратом, но и обеспечивает надежную локализацию ферментативной активности in situ.

Рис. 4. Схема метода субстратной пленки (Pearse, 1972).

А. Необработанный материал. Б. Материал в процессе обработки. В. Пленка и срезы ткани после разделения и окрашивания. J - предметное стекло, 2 - пленка н§ желатины с ДНК, 3 - срез ткани, 4—желатина—глицерин, 5 - окрашенная пленка с ДНК, 6 — неокрашенный участок, 7 — окрашенный срез ткани.

JOmm

Рис. 5. Приспособление для работы по методу с полупроницаемой мембраной (объяснение в тексте).

/—срезы, 2 — полупроницаемая мембрана, 3 — инкубационная среда с агаром, 4 — сосуд для инкубации.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 221

Принцип метода заключается в отделении среза ткани от среды мембраной, препятствующей проникновению белка (диализная трубка). Поскольку срез ткани наносится на такую мембрану с наружной стороны, последняя заменяет предметное стекло. На практике применяют цилиндр из легкого металла или пластмассы, который на специальном приспособлении помещается в термостат на время инкубации (рис. 5). Цилиндр наполняют средой с агаром; среда соприкасается с мембраной со стороны, противоположной той, на которой находится срез. По окончании инкубации срез ткани вместе с мембраной снимается с цилиндра. После удаления агара срез можно фиксировать 4%-ным формалином, обезводить, прикрепить к предметному стеклу и заключить в глицерин — желатину.

С помощью метода полупроницаемых мембран был выявлен целый ряд лизосомных (Lojda) и окислительных ферментов (Meijer) с хорошей локализацией. Очевидно, эн-зимогистохимические методы с использованием полупроницаемых мембран особенно пригодны для изучения различных аспектов метаболизма.

4.5.8. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ

КАЛЬЦИЙ-КОБАЛЬТОВЫЙ МЕТОД ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ПО ГОМОРИ (GOMORI, 1952)

МЕТОДИКА

1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине, 10 ч при +4° С, или в этанол— — ацетоне (1 :1) при + 4°С, 12 ч.

2. Дальнейшая обработка препарата:

а) после фиксации в формалине

Многократная промывка кусочка ткани в дистиллированной воде и приготовление срезов в криостате.

б) после фиксации в этанол — ацетоне по Гёсснеру

(Gossner)

Обезвоживание и заливка в парафин согласно следую-

222 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

щей схеме:

3 смены ацетона эфир—этанол (1 :1) 2%-ный целлоидин в эфире 2 смены бензола

каждая по 3 ч 3 ч (при 4° С) 12 ч

каждая по 30 мин при комнатной температуре

Пропитка парафином в вакууме (вакуумный шкаф или водоструйный насос) при температуре от + 54 до + 56°С, 30 мин, с последующей заливкой. Приготовление парафиновых срезов, расправление на плите с подогревом (не выше + 40°С), удаление воды фильтровальной бумагой и просушивание среза в термостате при 37°С, 30 мин. Де-парафинирование срезов и их проводка до дистиллированной воды по следующей схеме:

Ксилол—Ацетон (абсолютный)—Ацетон: во да (1:1)— Вода.

3. Инкубация полученных срезов после п. 2(a) или 2(6) в следующей инкубационной среде, от 5 мин до 4 ч при +37°С:

3%-ный натрий-Р-глицерофосфат 10 мл

2%-ный веронал-натрий ГО мл

Дистиллированная вода 5 мл рН 9,4

2%-ный СаС12 20 мл

5%-ный сульфат магния 1 мл

4. Срезы промыть в проточной воде.

5. Обработать 2%-ным раствором нитрата кобальта или ацетата кобальта, 3—5 мин.

6. Промывка в дистиллированной воде.

7. Обработка разбавленным раствором сульфида аммония, 1—2 мин.

8. Тщательно промыть в дистиллированной воде (до-краска в 1%-ном эозине, 5 мин, при необходимости).

9. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие щелочную фосфатазу, окрашиваются в черный или коричневато-черный цвет.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 223

КОНТРОЛЬ

Инкубация без субстрата; инкубация с добавлением в среду 0,05 М L-фенилаланина; срезы перед инкубацией прокипятить в течение 10 мин в дистиллированной воде.

ПРИМЕЧАНИЯ

При использовании заливки в парафин удается достичь хорошей локализации фермента, например в щеточной каемке эпителия тонкого кишечника или в клетках главного отдела почечных канальцев. Однако потери ферментативной активности в этом случае больше, чем при использовании замороженных срезов, фиксированных в формалине. Реакция в ядрах часто объясняется осаждением диффундирующих ионов фосфата в ядре.

свинцовый метод выявления неспецифических кислых фосфатаз по гомори (gomori. 1950)

МЕТОДИКА

1. Фиксация кусочков в холодном кальций — формате по Бейкеру, замороженные срезы. Криостатные срезы с постфиксацией в холодном кальций — формоле, 10—15 мин, или в холодном ацетоне, 15—30 мин.

2. Инкубация до 30 мин при 37°С в свежеприготовленном растворе субстрата:

». 0,05 М ацетатный буфер, рН 5,3 50,0 мл

3%-ный натрий-Р-глицерофосфат 5,0 мл Ацетат свинца или нитрат свинца 80 мг

3. Срезы промыть в четырех сменах дистиллированной воды, всего за 1—2 мин.

4. Обработать 0,5—1%-ным раствором сульфида аммония,