Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

буфер (рН 6,0) 6,5 мл

0,1 М цитрат натрия 0,5 мл

30 мМ сульфат меди 1,0 мл

Ингибитор (10~4 М изо-ОМФА) 1,0 мл

5 мМ феррицианид калия 1,0 мл

Сахароза 1,5 г

Рекомендуется прежде всего растворить в буфере ацетилтиохолиниодид, после чего добавлять все остальные компоненты инкубационной среды в указанном порядке. Растворы для инкубационной среды готовятся накануне; используется дистиллированная вода, перегнанная в стеклянной посуде. „ 6. Промывка инкубированных срезов в холодной 0,44 М сахарозе, 2x4 мин.

7. Дофиксация в 1%-ном 0804-з-коллидине (рН 7,2).

8. Обезвоживание, заливка в эпон или микропал (весто-пал), контрастирование срезов цитратом свинца по Рей-нолдсу, 10—15 мин.

РЕЗУЛЬТАТ

Активность ацетилхолинэстеразы, считающаяся специфичной после подавления холинэстеразы с помощью изо-ОМФА, маркируется осадком ферроцианида меди. Для

238 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

выявления неспецифической холинэстеразной активности вместо ацетилтиохолиниодида можно использовать бути-рилтиохолиниодид, а в качестве специфического ингибитора АХЭ— 1(Г3 М BW 284с51.

МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОГО АЗОСОЧЕТАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ 0-ГЛКЖУРОНИДАЗЫ ПО ХАЙЯСИ И ЛОЙДЕ (HAYASHI, LOJDA)

МЕТОДИКА

1. Фиксация маленьких кусочков ткани в холодном кальций — формоле по Бейкеру; приготовление замороженных или криостатных срезов после тщательной промывки кусочков ткани в растворе гуммиарабика и сахарозы по Хольту; свежие замороженные или криостатные срезы с использованием постфиксации в холодном кальций — формоле по Бейкеру тщательно промывают в дистиллированной воде или в растворе Хольта.

2. Инкубация в холодильнике при +4° С в течение ночи или при комнатной температуре 1—2 ч в следующем растворе:

а) Водная среда '

А) ОД M ацетат натрия 20 мл

Гексазоннйпарарозанилин (рН довести до 5,0 с 0,6 мл

помощью NaOH)

Б) Нафтол-А8-В1-&-Е)-глюкуронид 4 мг

Диметилформамид 0,5 мл А) и Б) хорошо смешать и отфильтровать

б) Среда для метода с использованием мембран по Лойде (Lojda, 1973)

A) 0,2 M ацетат натрия 10 мл Гексазоннйпарарозанилин (рН 5,0) 0,6 мл Б) Нафтол-А8-В1-Э-Г>глюкуронид 4 мг Диметилформадид 0,5 мл

B) 2%-ный агар в дистиллированной воде, разогретой на водяной бане (80—90° С)

3. Срезы хорошо промыть в дистиллированной воде или в 10%-ном формалине (несколько часов).

4. Заключение в глицерин — желатину.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 239

РЕЗУЛЬТАТ

Положительная реакция проявляется красным окрашиванием.

ВЫЯВЛЕНИЕ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (СТАНДАРТНЫЙ МЕТОД) МЕТОДИКА

1. Приготовление нефиксированных замороженных или криостатных срезов толщиной 5—10 мкм.

2. Срезы просушить и инкубировать 10—60 мин в следующей среде:

2,5 М ди-На-сукцинат 1,0 мл (6,75 г/10 мл, нейтрализовать 1 н. НС1)

Нитро-СТ (4 мг/мл) 2,5 мл

0,2 М трис-НС1-буфер (рН 7,4) 2,5 мл

5 мМ MgCl2 1,0 мл

Дистиллированная вода 3,0 мл

100 мМ KCN (65,1 мг/10 мл) 1,0 мл

Проверить рН и, если необходимо, довести его с помощью маточного раствора триса или 1 н. НС1 до 7,0—7,1.

3. Инкубационную смесь стряхнуть со срезов и фиксировать их в 10%-ном нейтральном формалине, 15—30 мин.

4. Промыть в проточной воде, 2 мин, и затем в дистиллированной.

5. Заключение в глицерин — желатину или обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Места сукцинатдегидрогеназной активности маркируются кристаллами формазана красного или синего цвета.

КОНТРОЛЬ

Инкубация без субстрата.

240 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЯ

Вместо нитро-СТ можно использовать нерастворимый в липидах ТНСТ в той же концентрации. Ингибирование системы цитохромов с помощью KCN усиливает реакцию, поскольку на восстановление соли тетразолия остается больше водорода. Непродолжительная фиксация маленьких кусочков ткани формальдегидом или глутаральдеги-дом способствует локализации фермента; она ведет, однако, к частичной инактивации фермента и осложняет суждение об истинной ферментативной активности. Согласно Андерсену и Хойеру (Andersen, Hoyer, 1973), хорошая локализация фермента in situ без потерь достигается с помощью следующей фиксации: 1%-ный забуференный, свободный от метанола формальдегид, приготовленный из параформальдегида (рН 7,2 устанавливается 0,2 М фосфатным буфером). Продолжительность фиксации 5 мин при температуре от 0 до + 4°С. Кусочки ткани следует вырезать быстро; толщина их не должна превышать 1—2 мм. Такая фиксация способствует проникновению нитро-СТ в ткань и повышает субстантивность формазана.

ВЫЯВЛЕНИЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ ПО БЁРСТОНУ (BURSTONE, 1959) МЕТОДИКА

1. Нефиксированные замороженные или криостатные срезы толщиной 5—10 мкм снимают с микротомного ножа охлажденной кисточкой, переносят на покровное или предметное стекло, расправляют и просушивают.

2. Срезы инкубировать при комнатной температуре 1—2 ч в следующей среде:

Нафтол-Ав-ЬЗ G,

или 1-окси-2-нафтойная кислота 10 мг п-Аминодифениламин

(N-фенил-и-фенилендиамин) 10 мг

растворяют в 0,5 мл этанола, добавляют 35 мл дистиллированной воды и 15 мл ОД М mpuc-буфера. После встряхивания раствор следует профильтровать.

3. Срезы для дофиксации и для образования комплекс-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 241

ной соли кобальта перенести в 1%-ный ацетат кобальта, растворенный в 4%-ном формалине, на 1 ч.

4. Тщательно промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Локализация фермента маркируется стабильным мелкозернистым коричневатым осадком красителя.

КОНТРОЛЬ

Обработка срезов ткани перед инкубацией в 0,1—1%-ном растворе цианида калия.

ПРИМЕЧАНИЕ

Благодаря своей простоте и стабильности продукта реакции метод Берстона является более совершенным, чем НАДИ-реакция.

МЕТОД С ТЕТРАЗОЛИЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ ПО ГЛЕННЕРУ И ДР. (GLENNER u. Mitarb.)

МЕТОДИКА

1. Нефиксированные замороженные или криостатные срезы толщиной 10—40 мкм поместить на покровное или предметное стекло и быстро просушить.

2. Инкубация 30—45 мин при +37° С в следующей среде:

Триптамингидрохлорид Сульфат натрия Нитро-СТ

0,1 М фосфатный буфер (рН 7,6) Дистиллированная вода

25 мг

4 мг

5 мг 5 мл

15 мл

3. Промывка в проточной воде, 2 мин; быстро промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин— — желатину.

242 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

РЕЗУЛЬТАТ

Места локализации моноаминоксидазной активности маркируются синими гранулами формазана.

КОНТРОЛЯ

Инкубация в среде без субстрата; предварительная обработка срезов на холоду в 10 ~ *М Р-фенилизопропил-гидразине в изотоническом растворе NaCl, 1 ч, или в 10 ~ 3 марсилиде (1-изоникотинил-2-изопропилгидразин) на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,6), 30 мин при + 37°С.

ПРИМЕЧАНИЕ

Метод отличается простотой и дает хорошо воспроизводимые результаты.

МЕТОД С ДИАМИНОБЕНЗИДИНОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ПО ГРЭХЕМУ И КАРНОВСКОМУ (GRAHAM, KARNOVSKY)

МЕТОДИКА

1. Кусочки ткани толщиной 3—4 мм фиксировать в смеси формалина и глутаральдегида; буфер рН 7,2, 5 ч при комнатной температуре.

Приготовление фиксирующей смеси: к 25 мл дистиллированной воды в колбе добавить 2 г параформальдеги-да и при постоянном помешивании нагревать до + 70° С. К этому раствору добавляют по-каплям 1 н. NaOH до просветления (2—3 капли). После охлаждения добавляют 5 мл 50%-ного глутаральдегида, 20 мл 0,2 М какодилат-ного буфера и 25 мг СаС12. Раствор тщательно перемешивают.

2. Кусочки ткани промывать в течение ночи в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2).

3. Замороженные или криостатные срезы должны быть толщиной 10—40 мкм; срезы, приготовленные на резаке, могут иметь толщину 50 мкм.

4. Инкубация в течение 3—10 мин при комнатной тем-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 243

пературе в следующей среде: 5 мг 3,3 -дааминобензидин-тетрагидрохлорида растворить в 10 мл 0,05 М трис-НС\-буфера (рН 7,6) и добавить ОД мл 1% Н202 (свежеприготовленной из 30% Н202). Сохранность инкубационной среды около 1 ч.

5. Срезы промыть в 3 сменах дистиллированной воды. Для световой микроскопии срезы заключить в глицерин — — желатину.

6. Для электронной микроскопии срезы дофиксировать в 1,3% Os04 на ОД М коллидиновом буфере (рН 7,2—7,4) с добавлением 5% сахарозы, 90 мин. (ОД М коллидиновый буфер рН 7,2—7,4: 2,67 мл чистого s-коллидина растворяют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 9 мл 1 н. НС1. Этот раствор доводят дистиллированной водой до 100 мл.)

7. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации; заливка в эпон.

8а. Срезы толщиной 0,5—1 мкм для световой микроскопии подвергают непродолжительному окрашиванию толуидиновым синим.

86. Ультратонкие срезы контрастируют растворами свинца.

РЕЗУЛЬТАТ

а) Места ферментативной активности (пероксидаза, ка-талаза) после п. 5 окрашиваются в коричневый цвет.

б) Продукт реакции представляет собой гомогенный электроноплотный осадок.

ПРИМЕЧАНИЯ

В отдельных случаях положительную реакцию могут давать и лизосомы. Согласно нашим наблюдениям, в п. 6 дофиксацию можно проводить в 1,3% Os04 на 0,1 М какодилатном буфере с рН 7,2—7,4 (вместо коллидинового буфера с 5%-ной сахарозой) в течение 90 мин.

244 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ВЫЯВЛЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ПО ГРЭХЕМУ, ЛУНДХОЛМУ И KAPHOB-СКОМУ (GRAHAM, LUNDHOLM, KARNOVSKY)

МЕТОДИКА

1. Маленькие кусочки ткани фиксировать при 0°С в за-буференном растворе формалина и сахарозы, 18 ч, с последующей промывкой в холодном 5%-ном растворе сахарозы, 24 ч.

2. Криостатные срезы толщиной 8 мкм нанести на покрытые желатиной покровные или предметные стекла и подсушить на воздухе.

3. Срезы инкубировать при комнатной температуре в следующей среде: 2 мг З-амино-9-этилкарбазола растворить в 0,5 мл диметилформамида и добавить 9,5 мл 50 мМ ацетатного буфера (рН 5,0). Непосредственно перед употреблением добавить к раствору 1—2 капли 30%-ной

н2о2.

4. Срезы промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Пероксидазная активность

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)