Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ПО ЛИЛЛИ (LILLIE) МЕТОДИКА

1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин.

4. Гистохимия отдельных классов вещеицв и ферментов 251

2. Депарафинированные срезы довести до воды.

3. Поместить в 2,5%-ный раствор сульфата железа, 60 мин.

4. Промыть в 4 сменах дистиллированной воды, по 5 мин.

5. Поместить в 1%-ный раствор гексацианоферрата (III) калия в 1%-ной уксусной кислоте, 30 мин.

6. Промыть в 1%-ной уксусной кислоте.

7. Провести через ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне. Такой же цвет имеет гемосидерин.

ПРИМЕЧАНИЕ

После п. 6 возможно докрашивание ядер.

МЕТОД ЦИЛЯ - НИЛЬСЕНА (ZIEHL - NEELSEN) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ЛИПОФУСЦИНОВ

МЕТОДИКА

1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды.

3. Окрашивание срезов в раствоое карбол-фуксина при + 60°С, 3 ч (10 г основного фуксина, 50 г фенола, 100 мл этанола, 1000 мл дистиллированной воды).

4. Промывка в проточной воде.

5. Дифференцирование в 1%нной соляной кислоте в этаноле до тех пор, пока эритроциты станут розовыми.

6. Промывка в дистиллированной воде.

7. Докраска в железных квасцах или 0,5%-ном растворе толуидинового синего.

8. Промывка в проточной воде.

9. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

10*

252 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

РЕЗУЛЬТАТ

Кислотоустойчивые липофусцины ярко-красного цвета, а липопротеиды—красноватого. Ядра окрашиваются в темно-синий или синий цвет.

ПРИМЕЧАНИЕ

Из-за базофилии липофусцина слишком сильная докра-ска ведет к развитию темно-красного окрашивания.

ОКРАШИВАНИЕ НИЛЬСКИМ СИНИМ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ РАЗЛИЧИЙ МЕЖДУ МЕЛАНИНОМ И ЛИПОФУСЦИНОМ ПО ХУЭКУ (HUECK)

МЕТОДИКА

1. Любая фиксация, заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы поместить в дистиллированную воду. ч

3. Срезы окрашивать свежеприготовленным насыщенным водным раствором нильского синего, 30 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде.

5. Обесцветить 10%-ной перекисью водорода, 24 ч.

6. Промыть в проточной воде.

7. Заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Липофусцин окрашивается в синий цвет, меланин не окрашивается.

4.7. БИОГЕННЫЕ АМИНЫ

Термин «биогенные амины» охватывает физиологически и фармакологически важные низкомолекулярные органические основания, которые образуются в процессе обменных реакций в организме и находятся в тесной связи с белками и аминокислотами. Биогенные амины широко распространены в природе и встречаются как в животных,

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 253

так и в растительных тканях. Они играют важную физиологическую роль в передаче в нервной системе сигналов возбуждения и торможения (нейромедиаторы).

4.7.1. СВОЙСТВА, КЛАССИФИКАЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ

Биогенные амины образуются в процессе декарбоксилирования аминокислот. Важную роль при этом играют ферментативные системы. Ферменты, участвующие в метаболизме биогенных аминов, известны все без исключения.

Аминокислота Биогенный амин

Тирозин Тирам ин

Гйстидин Гнетам ин

^ Триптофан Триптамин

5-окситриптофан Серотонин (5-окси-

триптамин)

Гистохимически важные биогенные амины: 5-окси-триптамин, триптамин, тирамин, адреналин, норадрена-лин и дофамин являются моноаминами. Их принято делить на 2 группы—катехол амины и индол амины.

Катехоламины' являются производными аминокислоты тирозина, которая в свою очередь может образовываться из фенилаланина. Катехоламины, к которым принадлежат адреналин, норадреналин и дофамин, имеют катехиновое ядро (-диоксифенильную группу) (рис. 7).

Индоламины образуются из аминокислоты триптофана или родственных ей продуктов, таких, как 5-окситриптофан. Их ядром является индольная группа. К индолами-нам принадлежит серотонин (5-окситриптамин).

Концентрация биогенных аминов в большинстве органов, особенно в мозге, очень низка (табл. 45).

Поэтому для их топохимического выявления в нервной системе пригодны лишь высокочувствительные реакции конденсации на лиофилизированной ткани мозга. В других тканях (например, в желудочно-кишечном тракте, мозговом веществе надпочечника) выявление этих активных веществ уже давно было осуществлено с помощью хромаффинных или аргентаффинных реакций. Из ряда доступных

254 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

н н I I

C-C-MHi

н соон

н н I

JksJ н с

NH2

соон

он

н н I I с-с

соон

ЫНг

Н Н

но у

ОН

он

Фенилаланин

Тирозин

C-C-NH2

Н Н

I I

с-с-мн2 онн

ДОФА

Доа>амин

Норадреналин

НО

он

н н I I

C-C-NH „ I | I Адреналин ОНН СН3

Рис. 7. Схема образования катехоламинов из аминокислот (Schadej.

Таблица 45

Концентрация биогенных аминов

в неокортексе у собаки и кошки, иг/г__

Область мозга \цетилхолин Дофамин Норадреналин Серотонин Гистамин

Неокортекс 2000 100 100 3Q0 100

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 255

гистохимическому выявлению биогенных аминов выпадает нейромедиатор ацетилхолин, для которого до сих пор не существует надежного гистохимического метода выявления. Разработка такого метода представляет собой важную задачу.

Помимо центральной и периферической нервной системы биогенные амины встречаются в эпителии желудочно-кишечного тракта, в мозговом веществе надпочечника (клетки, вырабатывающие адреналин и норадреналин), в островковой ткани поджелудочной железы, в щитовидной железе, тимусе и в фабрициевой сумке у птиц, а также в других органах. В центральной и периферической нервной системе биогенные амины встречаются большей частью в синаптических пузырьках, причем в центральной нервной системе содержание этих медиаторов в разных ядрах различно. Ретикулярная формация и гипоталамус, например, отличаются высоким содержанием норадреналина, а область полосатого тела—очень низким. Дофамин локализуется главным образом в области бледного ядра (pallidum) и скорлупы (putamen). Особенно большие количества катехоламина выявляются в пост-ганглионарных симпатических нейронах.

4.7.2. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ

Для гистохимического выявления биогенных аминов разработаны следующие методы:

1) хромаффинная реакция;

2) аргентаффинная реакция;

3) реакция окрашивания;

4) реакция конденсации.

Методы, используемые для выявления биогенных аминов в световой и электронной микроскопии, суммированы в табл. 46.

4.7.2.1. ХРОМАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ

В результате окислительного действия соединений, содержащих хром (например, бихромата калия), на целый

256 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

Таблица 46

Гистохимические методы выявления биогенных вминов (Hahn v. Dorsche u. Mitarb., 1975)

Метод Световая Электронная Аминогруппа/ амии

микроскопия микроскопия

Конденсация с формальдеги- + Катехоламин

дом серотонин

Конденсация с глноксиловой + То же

кислотой

Конденсация с о-фтальальде- + Гнстамнн, се-

гидом ротонин

Хромаффннная реакция + + Катехоламин

Аргентаффинная реакция + +

Реакция с перманганатом +

Реакция с нодом +

Осаждение солью Райнеке + + Гнстамнн, ка-

техоламин,

серотонин

Преципитация турнбулевой + Катехоламин

сини

Метод с солями тетразолия + »>

Метод с диазосульфаниловой

кислотой—азур А + »»

Метод с п-броманилином +

Метод с диазосафранином . +

ряд биогенных аминов образуется коричневый пигмент:

н

Норадреналин Норадренохром

Развитие коричневого окрашивания никак не связано с окрашивающим действием хромовых солей; оно появляется также и под действием других окислителей, не содержащих хрома, например иодата калия.

Эту в общем неспецифическую реакцию можно превратить в специфическую особым типом фиксации. Так, с помощью глутаральдегида можно отделить первичные амины (норадреналин, окситриптамин) от вторичного амина—адреналина. Формальдегидная фиксация с последую-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 257

щей хромаффинной реакцией ведет к окрашиванию серотонина, тогда как адреналин, норадреналин и дофамин не дают окрашивания.

4.7.2.2. АРГЕНАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ

Под аргенаффинностью понимают способность определенных структурных элементов восстанавливать аммиачный раствор серебра до металлического серебра без применения восстановителей. Процесс восстановления свидетельствует о наличии 5-окситриптамина (серотонина), норадреналина и дофамина. Адреналин дает отрицательную реакцию. Скорость восстановления серебра для разных аминов различна: норадреналин восстанавливает серебро за несколько секунд, дофамин примерно за 1 мин, а 5-окситриптамин—за 30 мин. На этом основании возможна дифференцировка 3 типов аминов.

Для выявления аргентаффинности в световой микроскопии наиболее пригоден метод Массона—Гамперля (см. Romeis, 1948 или 1968).

Для электронно-микроскопического выявления аргент-аффинных веществ рекомендуется метод Трамеццани, Киоккио и Вассерманна (см. Geyer, 1973).

4.7.2.3. РЕАКЦИИ ОКРАШИВАНИЯ

Из этой категории следует упомянуть в первую очередь три метода: диазониевая реакция, индофенольная реакция и реакция Гибса. В диазониевой реакции (реакция диазосочетания) в щелочной среде выявляются фенольные производные с незамещенной гидроксильной группой.

4.7.2.4. МЕТОДЫ КОНДЕНСАЦИИ

Перечисленные в табл. 46 методы конденсации, используемые для установления внутриклеточной локализации биогенных аминов, основаны главным образом на методе флуоресценции с формальдегидом по Фальку и Хилларпу (Falck, Hillarp), для которого можно использовать как парафиновый материал после замораживания — — высушивания, так и высушенные криостатные срезы.

258 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

При этом образуются флуорофоры, которые можно анализировать и подвергать количественной оценке с помощью микроспектрофлуориметрического анализ

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)