а.

Вместо формальдегида можно использовать глиокси-ловую кислоту в качестве флуоресцирующего гистохимического реагента на биогенные амины.

4.7.2.4.1. МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ

При обработке парами формальдегида происходит конденсация катехоламина и 5-окситриптамина в очень мягких условиях в присутствии белков или определенных аминокислот. При этом образуются интенсивно флуоресцирующие 3,4-дигидроизохинилины (III) или производное Р-карболина. 3,4-дигидроизохинолин представляет собой дегидрог енированный 1,2,3,4-тетрагидрохинолин (II).

Дигидроизохинолины (III) находятся в рН-зависимом равновесии со своей таутомерной хиноидной формой (IV). Этот компонент ответствен за флуоресценцию при гистохимической реакции.

ii

Ш

ш

iy

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 259

Поскольку продукт реакции, по-видимому, связан частично м этиленовыми мостиками с белками, его не удается экстрагировать органическими растворителями. Срезы свежей и фиксированной формалином нервной ткани, полученные на вибратоме при температуре от 0 до + 5°С, подвергают высушиванию на воздухе и воздействию паров формальдегида; на таких срезах удается выявлять катехоламины высокочувствительным стандартным методом Фалька—Хилларпа. Измерение с помощью микро-спектрофлуориметра спектров возбуждения и флуоресценции таких продуктов конденсации дает возможность дифференцировать в клетках различные амины, такие, как норадреналин, дофамин и 5-окситриптамин. Параметры флуоресценции некоторых биогенных аминов и их предшественников, а также родственных им соединений суммированы в табл. 47.

Таблица 47

Параметры флуоресценции продуктов конденсации аминов я ¦х предпкствеяншков (Pearse)

Амин Возбуждение, Флуоресценция,

W* W"

1. .м-Тирамин 385 415/510

2. л<-Оксиамфетамин 385 415/510

3. Метарамннол 385 415/510

4. Дофамин 410 480

5. а-Метилдофамин 410 480

6. Дофа 410 490

7. а'Метилдофа 400 480

8. Норадреналин 410 480

9. Адреналин ¦* 410 480

10. а-Метилнорадреналин 410 480

П. 3,4-диоксифенилсерин 380 370

12. 3-метокситирамин 370 470

13. Триптамин 370 490

14. N-метилтриптамин 370 490

15. Триптофан 375 490

16. 5-окситриптофан 410 525

17. 5-окситриптамин 385-410 520-540

18. 6-окситриптамин 400 505

19. 5,6-диоксигриптамин 400 500

20. 5-метокснтриптамин 380 525

21. а-Метил- 410 520

5-окситриптамин

260 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

4.7.2.4.2. МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ С ГЛИОКСИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ

При воздействии паров глиоксиловой кислоты катехо-ламины и индоламины образуют интенсивно флуоресцирующие соединения. Эти пары вызывают, кроме того, сильную флуоресценцию N-ацетилированных индолами-нов (например, мелатонина), метоксилированных катехо-ламинов (например, 3-метокситирамина) и триптофан- или ДОФА-содержащих пептидов на NH2- или СООН-конце. Эти соединения не выявляются с помощью стандартного - метода Фалька—Хилларпа.

4.7.3. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ

ХРОМАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА И HOPA-ДРЕНАЛИНА ПО ХИЛЛАРПУ И ХЁКФЕЛЬТУ (HILLARP, H0KFELT)

МЕТОДИКА

1. Свежие, тонкие кусочки ткани (в первую очередь надпочечника) обрабатывают следующим раггвором: 5%-ный бихромат калия К2Сг207, 90 мл, 5%-ный хромат калия К2Сг04, 10 мл (рН 5—6), 1—2 дня.

2. Промывка в дистиллированной воде, 30—60 мин.

3. Приготовление замороженных срезов, промывка их в дистиллированной воде, заключение в глицерин—желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Клетки, содержащие адреналин и норадреналин, окрашиваются в темно-коричневый цвет. После фиксации глу-таральдегидом окрашиваются только те клетки, в которых содержится норадреналин.

ПРИМЕЧАНИЯ

Реакция с биохроматом калия позволяет выявлять лишь вещества в достаточной концентрации. Практически этим условиям удовлетворяет только мозговое вещество

4. Гистохимия отдельных классов, веществ и ферментов 261

надпочечника. Поскольку горячий парафин частично вымывает окрашенный продукт реакции, заливки в парафин следует избегать.

РЕАКЦИЯ ДИАЗОСОЧЕТАНИЯ ДЛЯ АРГЕНТАФФИННЫХ ГРАНУЛ В КЛЕТКАХ

МЕТОДИКА

1. Фиксация в формалине, заливка в парафин.

2. Дешфафшшрованные срезы довести до дистиллированной воды.

3. Срезы обрабатывать в течение 30 с в следующем растворе: 1 мг/мл соли прочного красного В в 0,1 М веронал-ацетатном буфере, рН 9,2.

4. Тщательная промывка в воде.

5. Окрашивание ядер в железных квасцах по Манеру, 6—10 мин.

6. Промывка в проточной воде, 30 мин.

7. -Ряд спиртов, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Фенольные производные гранул в аргентаффинных эн-терохромаффинных клетках окрашиваются в оранжево-красный цвет, а ядра—в синий.

ПРИМЕЧАНИЕ

'Вместосоли прочного красного В можно использовать другие, устойчивые соли диазония, такие, как гранатовый прочный, соль прочного синего В. Растворы этих диазосое-динений не подлежат длительному хранению.

МЕТОДЫ КОНДЕНСАЦИИ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ НА КРИОСТАТНЫХ СРЕЗАХ ПО СПРИГГСУ, ЛЕ-ВЕРУ, РИСУ И ГРЭХЕМУ (SPRIGGS, LEVER, REES, GRAHAM, 1966), РЕЙТЕРУ (REUTTER, 1968) [ЦИТ. ПО АРНОЛЬДУ (ARNOLD, 1968)]

МЕТОДИКА

1. Свежие кусочки ткани заморозить на сухом льду или

262 4. Гистохимия отдельных класов веществ и ферментов

в изопентане (предварительное охлаждение жидким воздухом или жидким азотом).

2. Криостатные срезы толщиной 15—20 мкм поместить на покровное стекло и высушивать несколько недель в плотно закрытой кювете над пятиокисью фосфора при — 20°С, лучше всего в криостате.

3. Срезы обрабатывать при + 80°С в эксикаторе пара-формальдегидом, 2 ч. (Для установления постоянного уровня влажности 50 г параформальдегида выдержать в течение недели нйд 25%-ной серной кислотой в эксикаторе.)

4. Заключить в парафиновое масло и исследовать с помощью флуоресцентного микроскопа.

РЕЗУЛЬТАТ

Катехоламин дает флуоресценцию от зеленого до желто-зеленого цвета (максимум спектра возбуждения— 410 нм, максимум спектра флуоресценции—480 нм). Серотонин дает флуоресценцию от желтого до оранжевого цвета (410 нм/525 нм).

конТРОЛИ

1. Окситирамин и норадреналин дают с параформаль-дегидом флуоресцирующие продукты конденсации за 1 ч, а адреналин и серотонин—за 3 ч.

2. Флуоресцирующие 3,4-дигидроизохинолины и 3,4-ди-гидрокарболин восстанавливаются спиртовым раствором боргидрида натрия (NaBH4) до нефлуоресцирующих 1,2,3,4-тетрагидропроизводных. Повторная обработка парами параформальдегида вновь переводит эти соединения в, флуоресцирующую форму.

МОДИФИКАЦИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ФАЛЬКА—ХИЛЛАР-ПА ПО ХЁКФЕЛЬТУ И ЛЬЮНГДАЛЮ (HOKFELT, LJUNGDAHL, 1972)

МЕТОДИКА

Для нефиксированной ткани:

1. Быстро извлеченную нервную ткань помещают в хо-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 263

лодный раствор Тироде без кальция (вместо СаС12 используется MgCl2). (См. Schulze-Graupner.)

2. Приготовление срезов ткани толщиной 20—40 мкм с помощью вибратома. Ткань при этом заливается холодным (ниже + 5°С) раствором Тироде.

3. Перенос срезов на покровное стекло; избыток буферного раствора отсасывается фильтровальной бумагой.

4. Высушивание срезов в токе теплого воздуха (например, с помощью фена), 15 мин, или перенос в плотно закрытую кювету со свежей пятиокисью фосфора.

5. Срезы помещают на ночь в эксикатор и затем при + 80°С обрабатывают в нем же параформальдегидом, 1 ч.

6. Заключение хранящихся в эксикаторе срезов в ксилол, иммерсионное масло или в флуормаунт (Е. Gurr); флуоресцентная микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие катехоламин, дают четкую зеленую флуоресценцию. Для фиксированной ткани:

1. Наркотизированных (нембутал) крыс подвергают перфузии холодным 40%-ным или 10%-ным формальдегидом (приготовленным из параформальдегида по Пирсу) в 0,1 М фосфатном буфере в течение 15 мин. Для получения специфической флуоресценции катехоламина требуется во время перфузии держать исследуемых животных на ледяной бане (смесь льда, воды и NaCl, примерно — 2°С).

2. Кусочки из быстро извлеченного мозга подвергают дофиксации в холодном 4%-ном формальдегиде, 10—20 мин.

3. Приготовление срезов толщиной 10—20 мкм на виб-ратоме для дальнейшей обработки в соответствии с предыдущей прописью, начиная с п. 3.

РЕЗУЛЬТАТ

При точном соблюдении всех пунктов данной процедуры структуры, содержащие катехоламины, дают четко локализованную зеленую флуоресценцию.

264 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЯ

В отличие от замораживающего микротома и криоста-та вибратом позволяет получать срезы без разрывов. При использовании ткани, фиксированной формалином, можно на серийных срезах или даже на тех же срезах провести реакцию на холинэстеразу, импрегнацию серебром по Финку—Хаймеру или иммуннофлуоресцентное исследование в сочетании с флуоресцентным методом. Фиксация и обработка срезов при низкой температуре в значительной степени ослабляют диффузию катехоламинов.

МЕТОД КОНДЕНСАЦИИ С ГЛИОКСИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ ПО БЬЁРКЛУНДУ И ДР. (BJORKLUND ET AL., 1973)

МЕТОДИКА

1. Наркотизированных взрослых крыс подвергали перфузии; через восходящую аорту вводили 50 мл охлажденной на льду 2%-ноЙ глиоксиловой кислоты на бикарбонат-ном буфере Кребса—Рингера [рН буфера доводится до 7,0 с помощью NaOH) в течение 3—5 мин.

2 Кусочки быстро извлеченного мозга помещают в холодный буфер.

3. Приготовление срезов толщиной 20—50 мкм на виб-ратоме (при приготовлении срезов кусочки ткани следует заливать бикарбонатным буфером Кребса—Рингера, рН 7.0).

4. Сразу или после 5-минутной обработки в перфу-зионной среде с глиоксиловой кислотой, охлажденной на льду, перенести срезы на предметное стекло.

5. Удалить избыток буфера фильтровальной бумагой.

6. Высушить срезы в токе теплого воздуха, 15 мин.

7. Поместить на ночь в эксикатор с пятиокисью фосфора под вакуумом.

8. Проведение конденсации с глиоксиловой кислотой. Для этой цели срезы подвергают следующей обработке: 2 г глиоксиловой кислоты (в