Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ысушенной над пятиокисью фосфора в течение 24 ч) нагревают при 100°С в течение 1 ч в закрытом сосуде, соединенном с реакционным сосудом. После этого из реакционного сосуда откачивают ва-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 265

куумным насосом воздух до 300 мм рт.ст.; в сосуд впускают горячий, насыщенный глиоксиловой кислотой воздух, а затем теплый воздух до нормального атмосферного давления. Температура на протяжении всей реакции составляет + 100°С.

В качестве контроля служат неперфузированные срезы мозга, не подвергнутые обработке глиоксиловой кислотой.

9. Заключение срезов в жидкий парафин и исследование их под флуоресцентным микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие катехоламины, дают интенсивную флуоресценцию.

ПРИМЕЧАНИЯ

При использовании светофильтров BG 12/44 + 47 (Schott/Zeiss)y катехоламинов отмечается голубовато-зеленая флуоресценция. Клетки, содержащие индоламины, дают варьирующую коричневато-желтую флуоресценцию.

Приготовление срезов на вибратоме не позволяет получать серийные срезы одинаковой толщины.

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НОРАДРЕНАЛИНА С ПОМОЩЬЮ ХРОМАФФИННОЙ РЕАКЦИИ ПО ВУДУ И БАРНЕТТУ (WOOD, BARRNETT, 1964)

ПРИНЦИП

См. хромаффинную реакцию (стр. 260). Гранулы норадреналина дают при рН 4 отчетливый контраст, тогда как пузырьки с адреналином при этом же рН имеют довольно низкую оптическую плотность. На этом основании Вуд и Барнетт предлагают проводить реакцию при рН 4,1.

МЕТОДИКА

1. Фиксация тонких кусочков ткани 6,5%-ным глутаральдегидом на какодилатном буфере (рН 7,4), 2 ч.

266 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

2. Промывка в буферном растворе (0,1 М какоди-латный буфер, рН 7,47 на протяжении ночи).

3. Отпрепарированные участки ткани, содержащие ка-техоламины, инкубировать в течение 24 ч при + 4°С в следующем растворе: 5%-нъш биохромат калия, 50 мл; 0,2 М апетатный буфер (рН 4,1), 30 мл; сульфат натрия, 1 г.

4. Промывка в ацетатном буфере рН 4,1, 30 мин.

5. Возможна дофиксация в 1% Os04 с сахарозой, 1—2 ч; допускается также контрастирование срезов.

6. Обезвоживание, заливка в эпоксидные смолы или полиэфиры.

РЕЗУЛЬТАТ

Гранулы норадреналина дают отчетливый контраст. Гранулы адреналина имеют умеренную оптическую плотность и мелкозернистую структуру.

ПРИМЕЧАНИЕ

Дофиксация в Os04 ведет к контрастированию других компонентов клетки. При рН 6,5 выявляются'адреналин и норадреналин.

4.8. НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА

Топохимическое выявление внутриклеточных неорганических веществ сопряжено с большими трудностями из-за их низкой концентрации, хорошей растворимости и большой подвижности. Определенную помощь оказывает электронная микроскопия, позволяющая .наряду с точной структурной организацией выявлять небольшие количества веществ. На уровне световой микроскопии с помощью метода с сульфидом серебра возможно гистохимическое выявление очень малых количеств веществ благодаря образованию зерен серебра, имеющих объем больший, чем размеры выявляемых частичек тяжелых металлов. В последние годы в локализации элементов в биологическом материале начинает играть все большую роль метод рентгеновского микроанализа. "

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 267

Гистохимическое выявление неорганических веществ в световой микроскопии основано на следующих принципах:

1) образование лаков; 2) образование хелатов; 3) образование окрашенных солей; 4) замещение одного иона на другой с последующим выявлением.

Кроме того, существуют методы микросжигания и радиоавтографии. С помощью метода озоления среза можно получить хорошую обзорную картину распределения минеральных веществ в клетках и тканях. Этот метод может быть использован также и на ультратонких срезах.

Надежны и используются в практической работе методы выявления железа, кальция, калия. Выявление физиологически важных ионов натрия и хлора сопряжено с большими трудностями. При работе с этими методами предпочтение следует отдавать криостатным и замороженным срезам, а также лиофилизированному материалу; химическая фиксация и заливка ткани менее желательны.

В табл. 48 перечислены методы выявления неорганических веществ, которые могут быть использованы как в практической, так и в исследовательской работе.

4.8.1. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

ВЫЯВЛЕНИЕ ЖЕЛЕЗА, КАЛЬЦИЯ И КАЛИЯ ПРИ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

аУВыявление Fe(Il) по образованию турнбулевой сини (Tir-тап, 1898; Schmeltzer)

Принцип реакции описан на стр. 271.

МЕТОДИКА

1. Фиксация в формалине, замороженные или парафиновые срезы.

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды. (В результате обработки срезов 10%-ным раствором сульфида аммония в течение 1—24 ч выявляется также трехвалентное железо.)

Методы выявления металлов1)

Таблица 48

Металл

Реакция

Результат

Примечания

Ag

Al

Au

Ва

Be

Са

Си

Образование хела-та с рубеановодо-родной кислотой (Gedick, Pioch)

Образование лака с ауринтрикарбо-новой кислотой (Irwin, Gedick, Pioch)

Метод восстановления для неорганического золота (Christeller)

Родизонатный метол iWaterhouse, Pearse)

Метод с нафтохромовым зеленым-/] (Denz)

Щелочной солЬ-хром-азурин (Pearse)

(Метод с ализари-

Iновым красным S (Dahl, модификация McGee-Russel) {Метод с ядерным I красным (McGee-| Russel) (Метод с рубеано-! водородной кис-j лотой (Okamoto, Uzmann)

• Метод с диэтилди-I тиокарбаматом I (Waterhouse)

Соединение серебра темно-коричневого цвета

Соединение алюминия темно-красного цвета

Гранулы черного и темно-коричневого цвета

Черный осадок; после обработки НО - интенсивно тсрасного цвета

Соединения бериллия яблочно-зеленого цвета ^

Соединения бериллия черного цвета

Отложения кальция красно-коричневого цвета

Са, светло-красного цвета

Соединения меди черного цвета

Соли меди желто-коричневого цвета

Хорошая локализация

Специфична для солей алюминия

Выявляется исключительно только неорганическое золото

Неспецифнч еская реакция; дифференцировка от солей стронция путем обработки НС1

В кислом растворе нафтохромового зедеиого Са вымывается

Соединения Са удаляются при обработке кислотой

Неорганическое железо темно-красного цвета

Другие структуры розового цвета

Реакция после обработки парами концентрированной соляной кислоты может быть проведена также на парафиновых срезах

Проверенный метод для тканей беспозвоночных

Продолжение табл. 48

Металл

Реакция

Ре (улыат

Примечания

Fe (II)

Fe(HTJ

Метод турнбуле-вой сини (Tir-mann, 1898; Schmeltzer)

Метод берлинской лазури (Perls, Lison, 1936)

Метод с дифенил-

карбазидом

(Brandino, Lison) Метод Краута и

Дженнингса

(Crout, Jennings)

Метод с л-нитро-бензеназо-1-наф-толом

Метод с диметил-глиоксимом (Feigl)

Метод с хроматом (Fairhall)

Родизонатный метод (Molnar, Lillie, Gedick, Pioch)

Метод с диметил аминобензили-денрод амином (Okamoto, Mikami, Nishida)

Соединения железа (II) темно-голубого цвета

Соединения железа (III) темно-голубого цвета

Соединения Hg фиолетового цвета

Нитрит калия-кобальта в форме желтоватых кристаллов

Соли магния светло-синего цвета

Розовый различных оттенков

Соединения свинца выявляются в виде желтоватого хромата свинца

Фон нежно-голубого цвета, отложения свинца красного цвета

Соединения палладия красно-фиолетового цвета

По методу Лилли выявляется лишь небольшая часть имеющегося в ткани железа

Метод отличается высокой чувствительностью

Специфичность реакции зависит от рН

Реакция специфична, но локализация может быть ошибочной

Специфический метод с точной локализацией, но с плохой сохранностью окраски

Желательна предварительная обработка нативных или фиксированных в формалине криостатных срезов

Специфическая реакция с хорошей локализацией

Меры для повышения специфичности: окрашивание при кислом рН (2,8); предварительная обработка срезов разведенной H2S04

Чувствительный метод, однако не отличается специфичностью; кроме Pd реагируют Ag, Au, Hg и Си

270 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Продолжение табл. 48.

Металл

Реакция

Результат

Примечания

Zn

Pb,Au

Ag.Pt,

Fe.Cd. Си, Со, Ni,Zn Hg

Метод с дитизоном (Mayer u. Mitarb.)

Оксихинолиновый метод (Smith et al.)

Метод с сульфидом серебра для тяжелых металлов (Timm)

Соединения цинка от красного до пурпурно-красного цвета

Гранулы лейкоцитов дают флуоресценцию от белой до светло-зеленой

Перечисленные тяжелые металлы дают соединения коричнево-черного цвета

Хорошая локализация дитизоновой реакцией возможна лишь на срезах, прикреплен- ' ных к стеклу

После обработки 1%-ной уксусной кислотой флуоресценция исчезает

Метод со сравнительно низкой специфичностью,! но с высокой 1 чувствительностью

" Литературу см. у Romeis. 1968; Pearse, 1972.

3. Тщательно промытые в дистиллированной воде срезы обработать свежеприготовленным раствором, состоящим из равных частей 20%-ного водного раствора гек-сацианоферрата (III) калия и 1%-ной соляной кислоты в течение 10—20 мин.

4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.

5. При желании можно ядра докрасить ядерным прочным красным.

6. Промывка в дистиллированной воде.

7. Ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Соединения железа (II) окрашиваются в темно-синий цвет.

ПРИМЕЧАНИЕ

Надежность этого метода можно повысить путем контрольной экстракции железа. С этой целью ткань фикси-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 271

руют в 80%-ном этаноле, насыщенном H2S по Нету (Neth, 1968) в течение 24 ч при + 4°С с последующей обработкой при комнатной температуре в следующем растворе: 1 г 1,10-фенантролинийхлорида, 100 мл дистиллированной воды. Этот раствор сменить несколько раз до исчезновения красного окрашивания, после чего срезы промыть в дистиллированной воде. Провести реакцию выявления железа.

б) Выявление Fe (III) с помощью метода берлинской лазури (Perls, lison, 1936)

ПРИНЦИП

Обработка раствором гексацианоферрата (II) калия ведет в присут

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)