Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ствии Fe (ПТ) к образованию нерастворимого комплекса берлинской лазури.

МЕТОДИКА

1. Фиксация формальдегидом, заливка в парафин (замороженные срезы менее пригодны).

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды.

3. Срезы поместить в свежеприготовленный раствор, состоящий из равных частей 2%-ного гексацианоферрата (II) калия и 2%-ной соляной кислоты, в течение 30—60 мин (новый раствор использовать спустя 30 мин).

__4. Промывка в дистиллированной воде.

5. В случае необходимости окрасить ядра ядерным прочным красным; после этого промыть дистиллированной водой.

6. Ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Соединения железа (ИТ) окрашиваются в темно-синий цвет.

272 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЯ

Следует избегать контакта срезов с приборами, содержащими железо. Возможно проведение контрольной реакции с экстракцией железа.

в) Выявление кальция, модификация по Мак-Ги—Расселу (McGee—Russel)

ПРИНЦИП

Отложения кальция с ализарином S в зависимости от рН образуют окрашенный комплекс

МЕТОДИКА

1. Фиксация в формалине или в формалин—этаноле, заливка в парафин (кислые или металлосодержащие фиксирующие смеси менее пригодны).

2. Депарафинированные срезы поместить в 50%-ный этанол.

3. Быстро промыть в дистиллированной воде.

4. Под контролем микроскопии окрашивание ализариновым красным S (в 2%-ный раствор алийаринбвого красного S добавляют слабый раствор аммиака (1: L00), доводя рН до 4,1—4,3), 30 с—5 мин.

5. Срезы без промывки подсушить фильтровальной бумагой.

6. Поместить срезы в абсолютный ацетон на 10—20 с

7. Ацетон — ксилол (1:1), 10—20 с.

8. Ксилол, заключение в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Отложения кальция окрашиваются в оранжево-красный цвет (двойное лучепреломление); остальные структуры окрашиваются в розовый цвет.

ПРИМЕЧАНИЕ

При изменении рН могут окрашиваться другие неорганические соединения.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПЪ

г) Выявление калия по Крауту и Дженнингсу (Crout, Jennings)

ПРИНЦИП

Калий, находящийся в тканях, осаждается нитритом кобальта.

МЕТОДИКА

1. Замораживание—высушивание, заливка в парафин.

2. Лиофилизированные парафиновые срезы толщиной 10 мкм переносят для депарафинирования непосредственно в петролейный эфир (срезы к предметному стеклу не прикреплять!).

3. Свободноплавающие срезы поместить в новую смену петролейного эфира.

4. Срезы прикрепить к предметному стеклу (без покрытия стекол белком с глицерином) и высушить на воздухе, после чего прижать их слегка фильтровальной бумагой.

5. Обработать раствором нитрита кобальта, охлажденным на льду, 15 мин. (Раствор -нитрита кобальта: 25 г нитрита кобальта растворить в 7 мл воды, добавить 12,5 мл уксусной кислоты; 120 г нитрита натрия растворить в 180 мл дистиллированной воды; к раствору нитрита кобальта в уксусной кислоте добавить 210 мл раствора нитрита натрия. Смесь оставить на воздухе 1—2 ч для удаления N02, охладить в холодильнике и отфильтровать перед употреблением на холоду.)

*"6. Просушить фильтровальной бумагой, промыть в трех сменах дистиллированной воды, охлажденной на льду, по 15 с (пока не перестанут отделяться желтоватые облачка красителя).

7. Серия спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Нитрит калия — кобальта выпадает в осадок в виде желтовато-коричневых кристаллов.

274 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЕ

Реакция имеет достаточную специфичность, но следует считаться с возможностью смещения продукта реакции.

д) Выявление тяжелых металлов с сульфидом серебра по Тимму (Timm)

ПРИНЦИП

В результате обработки раствором, содержащим H2S, происходит образование труднорастворимых аргиро-фильных сульфидов тяжелых металлов, на которых происходит осаждение серебра из восстанавливающей среды, содержащей нитрат серебра.

МЕТОДИКА

Необходимые растворы:

а) Раствор гуммиарабика: 20 или 40 г неизмельченного гуммиарабика растворить в 100 мл дистиллированной воды, оставив раствор стоять 7—14 дней, (100, мл).

б) 10%-ный водный раствор нитрата серебра; свежеприготовленный! (1 мл).

в) Восстанавливающая среда.' 5 г лимонной кислоты и 2 г гидрохинона растворить в 100 мл бидистиллированной воды (10 мл). Растворы а, б и в (проявляющий раствор) смешать непосредственно перед употреблением.

1. Фиксация маленьких кусочков ткани в 70%-ном этаноле, насыщенном H2S (добавить 2 капли концентрированного аммиака к 100 мл) 10—12 ч; заливка в парафин.

2. Срезы, толщиной 6—8 мкм, прикрепленные к предметным стеклам (без приклеивающего вещества) довести через ксилол и ряд спиртов убывающей концентрации до дистиллированной воды.

3. Срезы, прикрепленные к предметным стеклам, помещают в плоские чашки, осторожно заливают проявляющей средой и проявляют в темноте при + 20°С до тех пор, пока срезы не приобретут светло-коричневый цвет, от 20 до 60 мин, максимально 6 ч.

4. Промыть в дистиллированной воде.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 275

5. Докраска ядер ядерным прочным красным или гемалау-ном.

6. Промыть в дистиллированной и проточной воде.

7. Серия спиртов, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Тяжелые металлы (Pb, Pt, Au, Ag, Fe, Cd, Cu, Co, Ni, Zn, Hg) окрашиваются в темно-коричневый цвет. Ядра окрашиваются в синий (гемалаун) или в красный (ядерный про чный красный) цвет.

ПРИМЕЧАНИЯ

Специфичность реакции можно повысить, используя контроли. Образование осадка в процессе окрашивания можно ослабить путем использования бидистиллирован-ной воды в кварцевом стекле.

е) Метод с сульфидом серебра для криостатных срезов по Брунку и Шельду (Brunk, Skold)

МЕТОДИКА

1. Из свежей ткани вырезать тонкие кусочки (максимальная толщина 2 мм).

2. Кусочки ткани обработать во влажной камере при температуре + 20°С парами H2S, 20 мин.

3. Криостатные срезы толщиной 6—8 мкм прикрепить на,лредметные стекла.

4. Дальнейшая обработка по стандартному методу Тимма (п. 3, проявление срезов).

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НАТРИЯ И ХЛОРА

а) Электронно-микроскопическое выявление натрия по Комнику (цит. по Geyer, 1973)

ПРИНЦИП

Ионы Na+ осаждаются гексаоксиантимонатом калия

276 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

K[Sb(OH)6], с которым они дают нерастворимый осадок: K[Sb(OH)6] + Na+ Na[Sb(OH)6] + К+ .

МЕТОДИКА

Фиксация очень маленьких кусочков ткани в 1% Os04 с 2%-ным раствором K[Sb(OH)6] при постоянном встряхивании при +1° С, от 60 до 90 мин. Фиксирующий раствор: гексаоксиантимонат калия растворить в дистиллированной воде на водяной бане и после охлаждения добавить Os04. рН раствора довести 0,01 н. уксусной кислотой до 7,2—7,4.

2. Кусочки ткани без предварительной промывки провести через ряд ацетонов (10, 30, 50 и 70% по 5 мин), затем провести через 90%-ный ацетон (10 мин) и через 3 смены абсолютного ацетона (по 10 мин). Для контрастирования в 70%-ный ацетон добавляют 1%-ную. фосфовольфрамо-вую кислоту и 0,5%-ный уранилацетат.

3. Заливка в эпоксидные смолы или полиэфиры.

РЕЗУЛЬТАТ

Продукт осаждения—Na[Sb(OH)6] дает отчетливый контраст.

ПРИМЕЧАНИЕ

Следует учитывать, что, помимо натрия, гексаоксиан-тимонатом калия могут осаждаться и ионы других металлов (например, Са, Mg, Ва, Zn, Fe) и некоторые амины (гистамин, спермин).

б) Электронно-микроскопическое выявление хлора по Ком-нику (цит. по Geyer, 1973)

ПРИНЦИП

Хлор осаждается ионами Ag + (ацетатом или лактатом

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 277

серебра) в виде нерастворимого осадка:

СН3СНОНCOOAg + СГ -* AgCl + СН3СНОНСОО" .

МЕТОДИКА

1. Фиксировать маленькие кусочки ткани, постоянно помешивая (+ 1°С) в темноте или при слабом красном свете, 2 ч. Фиксирующая смесь: 1,5% Os04, а также 1%-ный лактат серебра в 0,05—0,1 М какодилат-уксусном буфере, рН 6,4—6,6.

2. Кусочки ткани поместить в темноте или при слабом красном свете в 10%-ный и 30%-ный ацетон по 5 мин.

3. Дифференцировать в 0,1 н. HN03 в 50%-ном ацетоне—2 смены по 5 мин.

4. Обезводить в 2 сменах (70%-ном и 90%-ном) ацетона по 5 мин и в 3 «Менах абсолютного ацетона по 10 мин.

5. Заливка в эпоксидные смолы и полиэфиры.

РЕЗУЛЬТАТ

Хлорид серебра выпадает в виде электроноплотного, мелкозернистого осадка.

ПРИМЕЧАНИЕ

Возможные артефакты диффузии осложняют выявление связи между наблюдаемым осадком и истинным распределением ионов in vivo.

5. РАДИОАВТОГРАФИЯ

Радиоавтография позволяет устанавливать локализацию радиоактивных веществ в клетках и тканях благодаря действию излучения на фотографическую эмульсию. Содержащиеся в эмульсии кристаллы бромида серебра выполняют роль микродетекторов радиоактивности.

Радиоавтография, которую в применении к исследованию локализации радиоактивности в тканях называют иногда гисторадиоавтографией, может дать ответ на следующие вопросы:

1. Где локализуется радиоактивность в данном объекте?

2. Сколько радиоактивного вещества содержится в объекте? ,

3. В каких веществах находится метка?

Кроме того, радиоавтография позволяет наблюдатв обмен веществ до уровня отдельных клеток и субклеточных структур и определять интенсивность их обновления. Благодаря этому радиоавтография является прекрасным дополнением гистохимии. Особенно ценные сведения по обменным процессам дает комбинированное использование гистохимии и радиоавтографии.

5.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Первые радиоавтографические исследования были проведены в 1924 г. на ткани почек с естественным радиоактивным элементом полонием-210. Однако свое подлинное место радиоавтографические методы завоевали лишь с открытием искусственной радиоактивности.

Различные изотопы химических элементов могут быть стабильными и нестабильными. Распад нестабильных изо-

5. Радиоавтография 279

топов сопровождается выделением энергии в форме радиоактивного излучения. Процесс радиоактивного излучения характеризуется периодом полураспада—временем, в течение которого распадается половина всей имеющейся массы радиоактивного изотопа. Для каждого радиоактивного изотопа характерен сво

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.11.2019)