Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

й период полураспада (табл. 49). Периоды полураспада разных изотопов варьируют от долей секунды до нескольких миллионов лет. В радиоавтографии используются преимущественно изотопы с периодом полураспада не менее нескольких дней.

Таблица 49

Изотопы, используемые в радиоавтографии, и некоторые их аажные параметры (Pearse, 1972)

Изотоп

Период полураспада

Испускаемое излучение

Максимальная энергия излучения, кэВ

Зн

14С 32р 35S

45Са 59Fe 90Сг

125т 131J

226Ra 232Th

12,3 года 5568 лет 14,2 дня

87.2 дня 164 дня

45.3 дня 28 дней 60 дней 8,07 дня

1,62-103 лет 1,39-Ю3 лет

Р Р Р Р Р

Р.У Р

J Р.У

<*>У

<*,У

18 156 1700 157 256 1561 544 34 812 478,459 401,395.

Для радиоавтографии пригодны радиоизотопы, испускающие заряженные частицы, т. е. а-, Р- и реже у-лучи. Источниками у-лучей являются, в частности, 51Сг и 1251. Практическое значение в радиоавтографии имеют, однако, главным образом источники Р-излучения. ос-Излучение лишь незначительно поглощается фотоэмульсией.

Р-Частицы—это электроны, выделяющиеся при превращении нейтрона в протон.

Источниками Р-излучения служат 3Н, 14С и 35S. Особенно подходящим для цитологических и гистологических исследований считается тритий (3Н). Его период полураспада продолжительностью 12,5 лет позволяет проводить протяженные во времени исследования. Правда, С обладает в 10 раз более продолжительным периодом полурас-

280 5. Радиоавтография

пада, но преимуществом трития является чрезвычайно низкая энергия и очень мягкое р-излучение, которое полностью поглощается слоем эмульсии толщиной 1 мкм; благодаря этому возможна более точная локализация источника излучения в исследуемой структуре и в 10 раз более высокое разрешение по сравнению с 14С (3Н—ОД мкм; 14С—2 мкм; рис. 8). Оптимальное радиоавтографическое разрешение при работе с тритием позволяет прослеживать за включением соответствующих

Слабое Сильное

в Эмильсия >

« 1 Срез

i 'Ж

Рис. 8. Образование зерен серебра в фотографической эмульсии (Chay-ent et al.).

при более сильном излучении разрешение снижается.

соединений, меченных тритием, вплоть до субклеточного уровня. Этот пример подчеркивает то большие значение, которое энергия излучения наряду с видом излучения и периодом полураспада играет в выборе изотопов для радиоавтографических исследований.

Во всех исследованиях с радиоактивным материалом необходимо строго соблюдать правила радиационной защиты!

5.2. ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ, ЭКСПОЗИЦИЯ

5.2.1. ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Эмульсии, используемые в радиоавтографических исследованиях, должны обладать следующими свойствами: а) высокой чувствительностью; б) возможностью четкой локализации; в) хорошим разрешением.

Высокая чувствительность обеспечивается значительно более высоким по сравнению с фотографической эмульсией содержанием бромида серебра. Точность локализа-

5. Радиоавтография 281

ции и разрешение зависят от размера кристаллов, диаметр которых составляет 0,04 и 0,3 мкм. Чем меньше кристаллы, тем, как правило, точнее локализация и выше разрешение. В световой микроскопии разрешение на радиоавтографах составляет 1 мкм; это означает возможность различения двух радиоактивных частиц, удаленных друг от друга на расстоянии 1 мкм. В электронной микроскопии разрешение выше в 5 — 10 раз. В мелкозернистых эмульсиях, используемых при микроскопической радиоавтографии, для дальнейшего повышения чувствительности увеличивают содержание бромида серебра. Чувствительность эмульсии характеризуется также числом зерен серебра, образующихся при прохождении одной частицы. Эффективность радиоавтографического метода характеризуется величиной отношения числа зерен серебра на радиоавтографе к числу актов распада в препарате.

В табл. 50 представлены данные о некоторых выпускаемых промышленностью эмульсиях. Из известных эмульсий типа Ilford для радиоавтографии при световой и электронной микроскопии наиболее пригодна Ilford L4. В цитологии с успехом используют эмульсию ORWO Кб. Надежные результаты дают также эмульсии Eastman-Kodak и Agfa-Gevaert.

5.2.2. ЭКСПОЗИЦИЯ

В процессе экспозиции излучение должно воздействовать на эмульсию достаточно долго для получения скрытого изображения. Воздействие на фотоэмульсию а- или Р-чайиц сразу же ведет к почернению, возрастающему в линейной зависимости от времени. Все кристаллы бромида серебра, с которыми сталкиваются частицы, восстанавливаются до мелких черных зерен (металлическое серебро).

Экспозиция, как правило, проводится всегда при Одинаковых условиях: а) при постоянной температуре ( + 4° С); б) при минимальной влажности в присутствии гигроскопических веществ, например хлорида кальция; в) в абсолютной темноте.

Для хранения экспонируемых препаратов используют, как правило, хорошо моющиеся, черные небольшие кон-

11-235

282 5. Радиоавтография

Таблица 50

Типы эмульсий, наиболее часто используемых в радиоавтографам, и их свойства

Тип эмульсии

Диаметр кристалла, мкм

Примечания

Ilford L4

ORWO Кб

Gevaert NUC 307

Eastman NTB 1 Kodak

Kodak AR 10

НИКФИ тип M (НИИХИМФОТО

Ленинград)

0,12 Пригодна для радиоавтографии при световой и электронной микроскопии, особенно для fl-частиц. Эту эмульсию следует перед употреблением разводить водой

0,16 Радиоавтография при световой и электронной микроскопии. Эмульсию всегда перед употоеблением следует разбавлять! (Осторожно! Взрывоопасна!)

0,07 Радиоавтография при электронной микроскопии, особенно для выявления бедных энергией (}-частиц (3Н>, но, кроме того, и для 14С

и 35S

0,29 Радиоавтография при световой микроскопии; хранится в виде гелей и пленок; преимущественно для а-и р-частиц низкой энергии (3Н)

0,20 В виде пленок (ири световой микроскопии); область применения: а-З-частипы, излучение Аугера; 3Н-и 1 ^-предшественники. Разрешение в среднем 2,5 мкм

0,14 Сходный с Ilford L4

тейнеры или ящики из пластмассы. Их хранят в холодильнике в специальной проявочной комнате.

Устанавливаемое экспериментальным путем время экспозиции зависит от следующих факторов: а) от вида изотопа, б) его дозы, в) типа эмульсии и г) задач опыта. При необходимости подсчета зерен серебра следует прекратить экспозицию в тот момент, когда зерна еще четко различимы отдельно друг от друга.

При установлении оптимального времени экспозиции пробные препараты помещают в проявочный бокс и подвергают их последовательному пробному проявлению че-

5. Радиоавтография 283

рез определенные промежутки времени. Зависимость между временем экспозиции и плотностью зерен серебра на единицу площади иллюстрирует графически рис. 9 (срезы печени мыши, 14С-аденин).

Ю го 30 40 50 60 Время, дни

Рис. 9. Связь между продолжительностью экспозиции и плотностью зерен серебра на единицу площади в меченых срезах печени мыши.

5.3. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАВТОГРАФОВ

Получение радиоавтографов в принципе состоит из следующих 6 этапов:

1. Введение метки (например, введение радиоактивных веществ животным, инкубация срезов в радиоактивных средах, нанесение радиоактивных веществ на объект).

2. Подготовка меченого объекта (подбор времени воздействия радиоактивным изотопом, взятие пробы и дальнейшая обработка).

3. Нанесение фоточувствительного материала на меченый объект.

4. Экспозиция (выдерживание меченого материала в контакте с фотоматериалом в светонепроницаемых контейнерах).

5. Фотохимическое проявление.

6. Оценка радиоавтографов.

5.4. РАДИОАВТОГРАФИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Для локализации радиоактивности используются следующие приемы:

284 5. Радиоавтография

1. Макрорадиоавтография (например, радиоавтография целого животного).

2. Микрорадиоавтография (радиоавтография микроскопических объектов).

5.4.1. РАДИО АВТОГРАФИЯ ЦЕЛОГО ЖИВОТНОГО

Этот прием используется главным образом при работе с мелкими экспериментальными животными, например мышами, крысами и морскими свинками, поскольку работа с более крупными животными связана с определенными техническими трудностями и чревата большим числом ошибок. Для приготовления срезов (толщиной около 20 мкм) требуется микротом с тяжелой станиной, который для работы при постоянной низкой температуре встраивается в криостат.

Быстрое замораживание экспериментального животного предотвращает смещение введенных радиоактивных веществ. Хорошо зарекомендовало себя на практике замораживание в смеси изопентана с жидким азотом при температуре — 150°С. Приготовленные срезы подвергаются дальнейшей обработке контактным» методом.

В основном радиоавтография на целых животных используется при изучении распределения в организме животного фармацевтических препаратов и их радиоактивных метаболитов.

5.4.2. МИКРОРАДИОАВТОГРАФИЯ

Для локализации радиоактивности в микроскопических объектах используются следующие методы:

а) Контактный метод.

б) Метод монтированных радиоавтографов.

в) Метод съемной пленки.

г) Методы с жидкими эмульсиями («методы погружения»).

д) Методы покрытия.

Эти методы можно использовать в исследованиях, проводимых на мельчайших организмах, таких, как бактерии и одноклеточные, а также на клетках и тканях.

При планировании эксперимента с применением ра-

5. Радиоавтография 285

диоавто! рафии в каждом случае следует предварительно выяснить, какой из методов наиболее пригоден для решения поставленного вопроса. В настоящее время наиболее часто используют метод погружения и метод съемной пленки. Для лабораторий, в которых радиоавтографические исследования проводятся лишь иногда, рекомендуется использование метода съемной пленки. Использование жидких эмульсий имеет значение в опытах, где требуется большое разрешение и при постановке больших серий экспериментов.

5.4.2.1. ОСНОВЫ IIРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ТКАНИ

Качество радиоавтографа в значительной мере зависит от качества среза. В частности, надо обращать внимание на следующее:

а) Фиксация, выбор которой всегда определяется условиями эксперимента, не должна оказывать химического влияния на радиоавтографическую пленку или эмульсию. Следует поэтому избегать использовани

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)