Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

я фиксирующих смесей, содержащих ртуть и свинец. К надежным фиксирующим веществам, например, относятся: метанол, Карнуа, Буэн, кальций—формол по Бейкеру.

Потери вещества при промывании в процессе обработки ткани можно предотвратить, используя вместо химической фиксации замораживание — высушивание. И наконец, при работе с нативными криостатными срезами можно избежать вымывания метки. Наиболее подходящими следует считать криостатные срезы, которые фиксируют для луч-шеи сохранности структур по окончании экспозиции непосредственно перед проявлением.

б) Для нанесения срезов ткани следует использовать полностью обезжиренные и чистые предметные стекла (обработка подогретой смесью бихромата калия с серной кислотой с последующим длительным промыванием в воде).

в) Парафиновые срезы необходимо тщательно депарафинировать (2 смены ксилола, ряд спиртов возрастающей концентрации; растворы для депарафинирования следует сменять после двукратного употребления!). Остатки парафина в срезе ткани препятствуют прикреплению эмульсии или съемной пленки.

286 5. Радиоавтография

5.4.2.2. АРТЕФАКТЫ ПРИ РАДИОАВТОГРАФИИ

Исследователь сталкивается главным образом со следующими артефактами:

а) Слишком сильное диффузное почернение («фон»). Причины: негодная эмульсия, проникновение света в процессе экспозиции, слишком высокая температура проявления, неправильный выбор проявителя или фиксатора, химическое воздействие на фотоматериал, исходящее от среза или предметного стекла.

б) Пятнистое почернение фона, не связанное с выявляемыми тканевыми структурами. Причины: отпечатки пальцев, пылинки, неполное депарафинирование срезов, механическое воздействие на эмульсию в процессе приготовления радиоавтографов или во время экспозиции.

в) Отслойка эмульсии или образование пузырьков под ней. Причины: неполное обезжиривание или депарафинирование предметного стекла, слишком большие различия в температуре сред, экспозиции и проявления.

г) Побурение или исчезновение зерен серебра на готовых радиоавтографах. Причины: слишком малое время экспозиции или слишком короткая промывка,, воздействие веществ на фотоматериалы при окрашивании и дифферен-цировке радиоавтографов.

д) «Выцветание»: под этим понимают побледнение скрытого изображения, в частности при слишком высокой температуре и высокой влажности в процессе экспозиции. В результате образуется меньше зерен серебра, чем можно было ожидать. Это явление особо неблагоприятно сказывается при длительной экспозиции.

5.4.2.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ РАДИОАВТОГРАФИЯ

Задачей количественной радиоавтографии является оценка содержания метки в клетках и тканях. Обычно для этих целей используются следующие приемы:

а) Подсчет зерен серебра на единицу площади эмульсии.

б) Подсчет следов (треков) на единицу площади эмульсии.

в) Подсчет меченых единиц (например, ядер).

5. Радиоавтография 287

г) Фотометрическая денситометрия.

При использовании радиоактивных изотопов, испускающих Р-частицы, подсчет зерен серебра осуществляется простейшим и наиболее надежным способом. Он позволяет количественно оценить низкие концентрации радиоактивных изотопов в небольших участках ткани. Поскольку плотность зерен серебра (число зерен на единицу площади) зависит от радиоактивности, то по числу зерен можно сделать вывод о содержании метки в данном участке.

При подсчете зерен серебра следует учитывать гранулы, имеющиеся в эмульсии без обработки препарата. С этой целью в контрольных препаратах подсчитывают число этих гранул на единицу площади и это число (так называемый «фон») вычитают из общего числа зерен на радиоавтографе.

В зависимости от особенностей препарата микрофото-метрирование радиоавтографов проводят, измеряя эффективность отражения или поглощения падающего света.

Для фотометрической оценки используются выпускаемые промышленностью микрофотометры. Стандартизация фотометрических измерений осуществляется с помощью электронной аппаратуры.

При подсчете треков учитывают испускаемые препаратом а-частицы, которые образуют в слое фотоэмульсии почти линейные, практически непрерывные треки. Этот прием позволяет выявлять различия между почернением фотоматериала, вызываемым радиоактивностью и другими "факторами. Этим методом можно исследовать также препараты с низкой радиоактивностью.

Фотометрическая денситометрия основана на выявлении общей активности на единицу площади с учетом характера распределения зерен серебра.

Изящной формой количественной радиоавтографии является количественное выявление ферментов с помощью меченых ингибиторов, основанное в первую очередь на стехиометрическом соотношении между числом молекул фермента и молекул меченого ингибитора. Убедительные результаты были получены с использованием 3Н-ДФФ (динитрофторфосфат, меченный тритием) для количе-

288 5. Радиоавтография

ственного выявления ацетилхолинэстеразы в концевых моторных пластинках.

В настоящее время количественная радиоавтография все чаще используется для оценки электронно-микроскопических препаратов. Хорошие результаты были получены, например, в работах по синтезу белка в митохондриях и по распределению ацетилхолинэстеразы в моторных концевых пластинках.

5.4.2.4. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ РАДИОАВТОГРАФИЯ

Для этого метода требуется специальная эмульсия с очень высоким содержанием галогенида серебра с небольшими зернами одинакового размера. Для электронно-микроскопической радиоавтографии пригодна тонкая фотографическая эмульсия толщиной в один слой зерен с гомогенно распределенными и плотно упакованными кристаллами; такие слои можно наносить на ультратонкие срезы методом погружения или методом покрытия. Надежные результаты дает эмульсия Ilford L4.

Из изотопов чаще всего используют; те, которые характеризуются низкой энергией излучения, например тритий; доза должна быть значительно выше (примерно в 10 раз), чем при световой микроскопии. Но и в таких случаях следует считаться со значительным рассеянием испускаемых частиц. Надежная локализация меченых веществ возможна с точностью до 0,1 мкм, иногда и с более высокой.

В цитохимических исследованиях все большее значение приобретает метод дополнительной импрегнации тонких срезов радиоактивными веществами. Это позволяет избирательно метить отдельные компоненты клетки. В исследовании водорастворимых радиоактивных веществ помимо методов замораживания—высушивания и замещения в замороженном состоянии можно использовать метод криоультрамикротомии.

Нанесенная эмульсия высушивается в токе воздуха, освобожденного от пыли. Экспозиция проводится в светонепроницаемых кассетах в присутствии осушающего вещества (хлорид кальция, пятиокись фосфора) при температуре холодильника, причем время экспозиции для тонких

5. Радиоавтография 289

срезов ткани должно быть значительно большим, чем для обычных радиоавтографов.

В случае успешно проведенной процедуры зерна серебра на радиоавтографах выглядят под электронным микроскопом как рыхлые мотки шерсти. Более подробные технические сведения читатель может найти у Гайера (Geyer, 1973).

5.4.3. МЕТОД СЪЕМНОЙ ПЛЕНКИ И МЕТОД ПОГРУЖЕНИЯ

5.43.1. МЕТОД СЪЕМНОЙ ПЛЕНКИ

Практическое значение и широкие возможности применения данного метода основаны главным образом на а) применении обычных фотоматериалов (фотопленки), б) сравнительной простоте выполнения.

К этому следует добавить высокую чувствительность фотоматериала и высокое разрешение.

Пел к (Pelc) следующим образом описывает свой вариант применения съемной пленки (цит. по Pearse, 1972).

МЕТОДИКА

1а) Фиксация небольших кусочков ткани в кальций— —формоле, этанол-уксусной кислоте (3:1) или Карнуа, обычная заливка в парафин. Мягкая заливка в парафин после фиксации в этанол-уксусной кислоте или Карнуа: 15 мин бензол (комнатная температура), 15 мин теплый бензол (+ 56°С), 4 смены жидкого парафина (+ 56°С) по 30 мин, затем заливка в парафин (+60° С). Приготовление парафиновых срезов (1 мкм или тоньше) и расправление срезов на теплой бане.

16) Криостатные срезы нефиксированной ткани с постфиксацией в этанол-уксусной кислоте в течение 15 мин. Для водорастворимого материала использовать нефиксированные криостатные срезы.

2. Прикрепление срезов на желатинизированные предметные стекла (предметные стекла, тщательно вымытые в смеси биохромата калия с серной кислотой, для желатя-низации помещают в следующий свежеприготовленный

290 5. Радиоавтография

раствор: 5 г желатины, 0,5 г хромовых квасцов, 1000 мл дистиллированной воды); в заключение просушить на воздухе.

3. Наложение пленки (п. 3—6 в темноте!): для этой цели пленка нарезается острым скальпелем или бритвой на полоски необходимой величины, снимается с подложки (съемная пленка!) и затем при комнатной температуре ( + 20° С) помещается на поверхность дистиллированной воды ( + 20°С) эмульсией вниз, от 3 до 5 мин (рис. 10). Плавающие кусочки пленки подхватывают предметным или покровным стеклом, на которое нанесен депарафини-рованный срез ткани, содержащей радиоактивную метку.

EZ3 Эмульсия

¦ Эмульсия ¦Желатина ¦Стекло

Б

Рис. 10. Метод съемной пленки (Harbers).

Л. От деление пленки от стеклянной пластинки. Б. Расправление пленки по поверхности воды и нанесение на предметное стекло, на котором находится ткань (остальные объяснения в тексте).

В результате светочувствительная эмульсия вступает в контакт с препаратом. Выступающие края пленки обертывают вокруг предметного стекла (рис. 10).

4. Высушивание покрытого пленкой препарата на воз-

5. Радиоавтография 291

духе (требуется повышенная влажность воздуха, около 60—70%), примерно 2 ч.

5. Экспонирование пленки в обычных имеющихся в продаже кассетах для засветки или в простых, собственного приготовления, светонепроницаемых картонных коробках; обычно при температуре от + 14 до + 16°С, а в случае более длительной экспозиции желательно при + + 4"С.

Экспозиция обычно длится от нескольких дней до нескольких недель в зависимости от трех факторов: характера излучения используемого радиоактивного изотопа, удельной активности радиоактивных веществ в опыте и чувствительности эмульси

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)