Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

и.

6. Проявление препарата в стеклянных кюветах или в проявочных сосудах при постоянной температуре (17—18°С) с.использованием нормальных проявляющих, промывочных и фиксирующих сред. Продолжительность проявления—30 мин; промывка—30 с; фиксация—4 мин при постоянном перемешивании.

В качестве проявителя рекомендуется: 2,2 г мономе-тил-п-аминофенолсульфата (элон); 72 г безводного сульфита натрия; 8 г гидрохинона; 48 г безводного карбоната натрия; 4 г бромида калия; 1000 мл дистиллированной воды. Перед употреблением фильтровать!

7. Тщательная промывка в проточной воде, 30—60 мин.

8. Заключение в глицерин—желатину для фазово-кон-трастной микроскопии или окрашивание препаратов гема-лауном—эозином или метиловым зеленым — пиронином.

"~9. При окрашивании гемалауном—эозином дифференцировать в 1%-ном растворе НС1 до тех пор, пока не начнут ясно вырисовываться ядра клеток, примерно 30—60 с.

10. Высушивание препаратов на воздухе (без пыли) при горизонтальном положении слоя пленки, 1 ч.

РЕЗУЛЬТАТ

Участки почернения (или точки) в фотоэмульсии свидетельствуют о наличии радиоактивности.

292 5. Радиоавтография

ПРИМЕЧАНИЯ

После п. 10 препараты можно обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации и заключить в нейтральный бальзам через ксилол. Окрашивание срезов можно также проводить еще до покрытия их слоем пленки. Для этого особенно рекомендуется реакция Фёльгена, поскольку фотографическая фиксация (п. 6) влияет на нее лишь незначительно.

Кроме упомянутых выше преимуществ метода съемной пленки, следует отметить постоянную толщину слоя эмульсии, наносимой в фабричных условиях, что обеспечивает воспроизводимость как в качественных, так и в количественных исследованиях. Этот фактор имеет особое значение при работе с изотопами, характеризующимися высокой энергией излучения.

Недостаток метода—невозможность его использования для электронно-микроскопической радиоавтографии, а также ограниченные возможности «применения в двухслойной радиоавтографии. Кроме того, слой желатины несколько снижает резкость изображения. Особенно это сказывается при исследовании препарата в темном поле при фотометрии (эффект рассеяния света в 'окрашенной желатине).

5.43.2. МЕТОД ПОГРУЖЕНИЯ

Метод погружения наряду с методом съемной пленки относится к наиболее часто применяемым в радиоавтографии. Эмульсии поставляются в форме геля и состоят из желатиновой основы с галогенидом серебра. Их можно наносить на препарат в виде очень тонкого слоя; в отличие от съемной пленки они не прокрашиваются вместе с препаратом. В преобладающем числе работ с использованием радиоавтографии в световой микроскопии применялась эмульсия Ilford L4 и К2. Хорошие результаты дает также эмульсия ORWO Кб.

Успех метода погружения зависит от целого ряда методических предпосылок, которые необходимо учитывать, чтобы избежать ошибок. Важно, особенно при использовании источников с более жестким излучением, надлежащим

5. Радиоавтография 293

образом разводить поставляемые эмульсии. Для световой микроскопии рекомендуется разведение эмульсии Ilford L4, К2 или ORWO Кб в соотношении примерно 1:1 при температуре + 40°С. Для тщательного перемешивания разведенных эмульсий используют вращающиеся мешалки.

Основные этапы метода погружения показаны на рис. 11. Все описанные операции следует проводить при красном свете с защитным фильтром, например ORWO № 107, с лампой мощностью 15 Вт.

Рис. 11. Основные этапы метода погружения (Junqueira et. al, 1975).

294 5. Радиоавтография

Амлахер (Amlacher, 1974) дает следующее описание метода погружения.

МЕТОДИКА

1. Выдерживание эмульсии в темной камере до выравнивания температур (18—20° С).

2. Взятие эмульсии из сосуда, в котором она поставлена фирмой. Эмульсии типа Ilford поставляются в виде отдельных навесок, помещенных в удобные для работы коричневые широкогорлые флаконы с навинчивающейся крышкой. Взятие эмульсии из термостатированного контейнера ORWO следует проводить, как этого требует техника безопасности, в очках и в маске для зашиты дыхательных путей. Эмульсии типа ORWO, поставляемые в виде грубых комков, следует перед употреблением размельчить стеклянной палочкой внутри сосуда. Эмульсию берут из сосуда стеклянным шпателем или стеклянной палочкой.

3. Подготовка эмульсии к использованию.

а) Кусочки эмульсии помещают в стеклянный стакан емкостью 50 мл (высота 6 см, диаметр 1—5 см), заполняя его до половины.

б) Стакан с эмульсией помещают в металлический патрон следующих размеров: высота 8 см, внешний диаметр 7 см, внутренний диаметр 4 см, глубина 4 см. Толщина стенки соответственно составляет 1,5 см.

в) Стеклянный стакан в металлическом патроне помещают на плиту с регулируемой температурой ( + 40°С). Для контроля за температурой на эту же плиту помещается заполненный дистиллированной водой стеклянный стакан большего размера с помещенным в него термометром. Нагревание эмульсии можно также проводить на водяной бане.

г) Как только эмульсия размягчится, проверяют, наполнен ли стакан до 25 мл (первая отметка); если нет, то добавляют эмульсию.

д) В стакан доливают до 50 мл (вторая отметка) 2%-ный раствор глицерина на дистиллированной воде, нагретый до -г-40°С.

е) Металлический стакан с эмульсией снимают с плиты

5. Радиоавтография 295

и разведенную эмульсию перемешивают на механической мешалке примерно 1 мин. После этого эмульсию оставляют на 5 мин для выхода из нее всех пузырьков воздуха. В эмульсию медленно и равномерно опускают чистое предметное стекло без среза. Вынув его, удостоверяются, действительно ли эмульсия перемешана равномерно и не содержит ли пузырьков воздуха.

ж) Для освобождения от пузырьков воздуха можно, вынув стеклянный стакан из металлического патрона, перелить эмульсию через воронку с мелкой капроновой сеткой в предварительно нагретый стакан.

4. Перед нанесением эмульсии препараты депарафини-руют, доводят до воды и высушивают. Предметные стекла, не покрытые слоем хромовых квасцов с желатиной, необходимо перед нанесением на них объекта обработать согласно п. 2 (см. стр. 289). Высушенные препараты следует хранить в условиях, не допускающих попадания пыли. Для нанесения на них эмульсии препараты предварительно нагревают до +40°С.

5. Нагретые предметные стекла с помощью зажима медленно погружают в эмульсию (лучше по одному) и медленно извлекают. Стекающую эмульсию отсасывают фильтровальной бумагой; стекла высушивают в вертикальном положении на воздухе в полной темноте не менее 2 ч. Предварительно можно стереть эмульсию с нижней поверхности предметного стекла, а затем поместить его для застывания на охлажденную плиту (10 мин).

6. Экспозиция, проявление при + 20°С, промывка в воде, при необходимости докраска; высушивание на воздухе (без пыли), заключение в нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Радиоактивность регистрируется в фотоэмульсии в виде участков почернения и отдельных точек.

ПРИМЕЧАНИЯ

Результаты в значительной мере зависят от качества слоя нанесенной эмульсии. Под влиянием температуры и влажности воздуха возможны неконтролируемые измене-

296 5. Радиоавтография.

ния толщины слоя в процессе высушивания (п. 5). При слишком быстром высушивании возможны так называемые артефакты механического сжатия. Однородные слои эмульсии с равномерным распределением зерен гало-генида серебра получают при высушивании в термостате при + 28 С (Leblond et al, 1963) или при + 40°С и относительной влажности воздуха 60—80% (Amlacher, 1974).

5.5. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОАВТОГРАФИИ

В настоящее время радиоавтография широко используется в различных исследованиях, где необходимо дать Истинную оценку меченых функциональных групп; этот метод можно считать наиболее важным. Многие исследования, проводимые с помощью радиоавтографии, направлены на изучение интенсивности белкового синтеза с использованием меченых предшественников белка и нуклеиновых кислот. При проведении эксперимента с учетом временных интервалов можно определять скорость обменных процессов. Радиоавтография позволяет установить локализацию и провести анализ процессов обмена углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот. Специальные исследования позволяют, например, определять локализацию и продолжительность синтеза ДНК в клеточ-номядреи в митохондриях, выявлять сульфатирование гли-копротеидов в аппарате Гольджи в бокаловидных клетках и фибробластах. Широкое привлечение радиоавтографии к световой и электронной микроскопии создает условия для решения актуальных проблем клеточной дифференцировки.

6. ИММУНОГИСТОХИМ ия

Этот бурно развивающийся раздел гистохимии использует способность организма к образованию специфических антител против чужеродного материала (антигенов). Антиген и антитело взаимодействуют друг с другом с высокой специфичностью. Антигены, антитела, а также комплексы антиген — антитело не видны под микроскопом. Можно, однако, получить конъюгат антител с флуоресцентным красителем, не вызывая при этом ослабления сродства антител к антигену. При нанесении такого конъюгата на срез ткани происходит специфическая реакция антиген —антитело, которую легко увидеть благодаря характерной флуоресценции в ультрафиолетовом свете при наблюдении в флуоресцентном микроскопе. На этом принципе основан метод флуоресцирующих антител, позволяющий локализовать специфические реакции антиген — антитело.

Метод флуоресцирующих антител складывается из следующих этапов (Barka, Anderson, 1964):

1. Приготовление специфической антисыворотки.

2. Приготовление и очистка у-глобулиновой фракции, или фракции специфических антител.

3. Конъюгация антител с подходящим флуоресцентным красителем (например, с изотиоцианатом флуоресцеина, родамином В, дансилом).

4. Очистка конъюгатов.

5. Подготовка срезов (можно использовать криостатные срезы, фиксированные в холодном ацетоне или этаноле, замороженные срезы, фиксированные в формалине, срезы материала, фиксированного замораживанием— высушиванием, замещением в замороженном состоянии или после фиксации на холоду и парафиновой заливки).

298 6. И мм уногистохимия

6. Реакция меченых антител со

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)