Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

м продуктом гистохимической реакции на перокси-дазную активность.

63. ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИИ

Быстрое развитие иммуногистохимических методов существенно расширило возможности применения этой важной ветви гистохимии. Ценность иммуногистохимии определяется ее возможностью весьма специфично маркировать и локализовать белки, в частности ферментные белки. Благодаря этому удается получать ценные дополнения к исследованиям, проводимым с помощью обычных гистохимических методов, направленных на выявление веществ или ферментативной активности. Обширной, еще мало разработанной областью применения гистохимии является специфическое выявление ферментных белков. Имеется в виду в первую очередь выявление растворимых ферментов, труднодоступных методам обычной энзимогистохи-мии. Применение иммуногистохимических методов для выявления ферментов имеет особое значение в тех случаях, когда специфичность данного метода и локализация фермента оспариваются.

Большое число фундаментальных исследований в области биологии и медицины по внутриклеточной локализации гормонов, в частности гормонов гипофиза, было проведено с использованием антител, меченных пероксидазой (рис. 15). Такие антитела позволили также идентифицировать антигены базальной мембраны и внутриклеточные иммуноглобулины в плазматических клетках и лимфобла-стах. Прекрасным примером иммуногистохимического выявления ферментов является установление локализации амилазы, трипсиногена и химотрипсиногена в экзосринных

Инкубация с J, 31диаминобензидином

Рис. 15. Внутриклеточное выявление гормонов гипофиза методами иммуноцитохимии (Junqueira et al., 1975).

/. Срезы обрабатывают в растворе, содержащем антитела против изучаемого гормона; антитела связываются с гормоном. //. Срез инкубируют с раствором, содержащим меченные пероксидазой антитела к антителам (у-глобулину). ///. Срез инкубируют с субстратом—3,3'-диаминобеизидииом, в результате образуется коричневый осадок в местах нахождения гормона.

306 6. Иммуногистохимия

клетках поджелудочной железы. В качестве антигенов использовали соответствующие кристаллические ферменты, которые вводили кроликам, растворяя их в буфере, и смешивали с адьюваном Фрейнда. После очистки кроличьих антител против соответствующего фермента и конъюгации с красителем выявляли образовавшийся комплекс антиген — антитело с присоединенным к последнему флуоресцентным красителем—изотиоцианатом флуоресцеина. Флуоресцирующие участки в срезе ткани соответствуют локализации антигена, а стало быть, и фермента.

7. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ

За последние два десятилетия количественная гистохимия превратилась в важнейшую отрасль гистохимии. Ее цель—количественное определение веществ на месте их прижизненной локализации. Выражаемая в относительных единицах интенсивность гистохимической реакции представляет собой более объективную оценку результатов опыта, чем простое наблюдение. Для проведения соответствующих измерений размера и формы клетки, а также определения содержания ее химических компонентов выпускается специальная, большей частью автоматизированная аппаратура.

7.1. ЦИТОФОТОМЕТРИЯ

7.1.1. МИКРОФОТОМЕТРЫ

При количественных исследованиях, проводимых с помощью цитофотометрической аппаратуры, измеряют поглощение света, интерференцию, флуоресценцию продуктов реакции и отражение света. Особенно широкое применение нашли однолучевые микроспектрофотометры (принципиальная схема этого прибора представлена на рис. 16), работающие в видимой области. Кроме того, с помощью микроспектрофотометров можно снимать спектры поглощения при любых длинах волн.

В качестве примера рассмотрим микроспектрофотометр, разработанный фирмой FEB Carl Zeiss Ампливал. Это однолучевой прибор, работающий в видимой области—от 400 до 710 нм; с его помощью можно измерять пропускание и поглощение света веществом, находящимся непосредственно в клетке. Необходимым этапом цитофо-

308 7. Количественная гистохимия

тометрических измерений является связывание красителя с выявляемым биологическим веществом. Измерив величину пропускания или экстинкции, можно вычислить концентрацию связанного в результате гистохимической реакции красителя и найти концентрацию исследуемого вещества.

Микроскоп Изображение .-.

(+) х 2 ° объект 1

Рис. 16. Схема микрофотометрии (Caspersson, 1950 и Sandritter, 1965).

/—лампа, 2—призма, 3—щель, ¦—фотоэлемент.

Микроспектрофотометр состоит из микроскопа Ам-пливал с апохроматическими объективами, оптической скамьи с источником света и светофильтрами, а также фотометрического устройства с фотометрической насадкой, фотометрической головкой и усилителем, тока с регистрирующим прибором В аппарате два источника света—один для просмотра препарата, другой для измерения. Последним служит галогеновая лампа мощностью 100 Вт, спектр испускания которой лежит в области 400—710 нм. С помощью самописца-и аналогового преобразователя результаты измерений либо печатаются на машинке, либо записываются на магнитную ленту.

Количественное определение флуоресцирующих соединений можно проводить с помощью цитофлуориметра, который представляет собой комбинацию флуоресцентного микроскопа с фотометром. Применение простого флуоресцентного микроскопа в сочетании с фотометром имеет, однако, серьезный недостаток: время возбуждения флуоресценции для одного измерения составляет несколько секунд. За это время интенсивность флуоресценции существенно уменьшается, что искажает результаты измерений. Следовательно, время возбуждения является важным параметром флуориметрии. Желательно поэтому, чтобы оно не превышало 1 с.

7. Количественная гистохимия 309

С помощью интерференционного микроскопа, снабженного измерительным компенсатором, можно определять толщину и коэффициент преломления микроскопического объекта, сухую массу живых и фиксированных клеток, а также проводить количественное исследование живых клеток и клеточных органелл.

Непрозрачные продукты, находящиеся в клетке, не поддаются исследованию методом интерференционной микроскопии. Особое значение в биологии и медицине имеет определение сухой массы живых и фиксированных клеток. В основе этих измерений лежит зависимость между концентрацией вещества, находящегося в растворенном состоянии в живой клетке, и коэффициентом преломления раствора. Для определения сухой массы можно пользоваться также методом гисторентгенографии.

Количественная микрофотометрия в отраженном свете (рефлектометрия) особенно ценна для определения числа частиц в осадке. В первую очередь она используется при подсчете точек, например осадков формазана или зерен серебра, на радиоавтографах.

7.1.2. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ

Основой фотометрического исследования окрашенных веществ в клетках и тканях является закон Ламберта—Бэра. Согласно этому закону, слои гомогенной поглощающей среды равной толщины поглощают равное количество света. При использовании красителей или гистохимических реакций окрашивания для выявления веществ в клетках и тканях количество связываемого красителя должно линейно зависеть от количества выявляемого вещества (стехиометричность связывания красителя). В реакции Фёльгена, используемой для выявления ДНК, связывание лейкофуксина с образующимися в результате гидролиза альдегидными группами происходит в стехиометриче-ском соотношении. Интенсивность реакции окрашивания зависит от числа альдегидных групп, а при соответствующих условиях и от количества ДНК.

Для определения ферментативной активности применимы те же требования.

310 7. Количественная гистохимия

При цитофотометрическом определении необходимо иметь в виду ряд обстоятельств:

а) надежность используемой оптической системы для измерения количества вещества (она достигается с помощью точной проверки и юстировки системы по соответствующим стандартам); б) характер подготовки препарата; в) точное соблюдение условий проведения гистохимической реакции; г) заключение срезов под покровное стекло в среду, которая не оказывает влияния на продукт гистохимической реакции.

Помимо уже упомянутого закона Ламберта—Бэра необходимо учитывать следующие предпосылки для получения надежных результатов измерения:

1. В процессе гистохимической реакции выявляемое вещество не должно смещаться в другие участки ткани или диффундировать в фиксирующую смесь или в инкубационную среду.

2. При фиксации не должно происходить вымывания исследуемого вещества и не должна изменяться его способность к последующей гистохимической реакции.

3. В гистохимическую реакцию должно вступать все присутствующее выявляемое вещество, а>количество образующегося при этом продукта должно линейно зависеть от количества выявляемого вещества.

Выполнение всех этих условий не всегда возможно. В некоторых случаях приходится в опытах на модельных системах подбирать'компромиссные решения. Возможность количественного определения продукта реакции сама по себе является шагом вперед по сравнению с субъективным методом (оценка интенсивности реакции числом крестов). Особенно важно сопоставление с результатами, добытыми с помощью других методов.

При цитофотометрии тонких срезов возникают определенные трудности, связанные с оптической негомогенностью срезов, подвергаемых гистохимической обработке. При работе со срезами одинаковой толщины возможные колебания в измерениях сглаживаются регистрацией цито-фотометрических данных по большому числу клеток (от 20 до 100). При этом следует иметь в виду, что число исследуемых клеток зависит от морфологии ткани. Точность измерений можно повысить, сканируя образец узким пучком

7. Количественная гистохимия 311

света при смещении препарата. Полученные данные дают интегральную оптическую плотность объекта. Еще одним путем измерения является фотометрирование при двух длинах волн.

При измерении поглощения света на окрашенных тканях необходимо перед началом измерений определить спектр поглощения для продукта каждой реакции окрашивания. Только таким образом можно проводить количественные измерения при оптимальной длине волны.

Одним из источников ошибок при цитофотометриче-ских и

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)