Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

усочки ткани примораживаются к тканедержателю в криостате на капле воды. Замороженный материал перед резкой лучше всего поместить на 30 мин в криостат для достижения оптимальной температуры резки от — 18 до — 20°С. При массивном заборе материала замороженные пробы можно хранить на сухом льду в помещенном в сосуд Дьюара пакете из синтетического материала для защиты от воздуха. Для успешного приготовления срезов имеют значение:

28 2. Методы гистохимии

1) правильная ориентация и правильная резка блоков ткани,

2) оптимальная температура,

3) правильная установка расправляющей пластинки. Оптимальная температура резки зависит от ткани. Для

различных тканей млекопитающих, например ткани печени, сердца, желез, мышц, наиболее благоприятная температура лежит между — 15 и — 20°С. Нервная ткань лучше всего режется при температуре от — 10 до — 15°С, тогда как для резки тканей с высоким содержанием жира требуется температура ниже — 20°С.

• Скручиванию срезов препятствует располагаемая параллельно оправе ножа расправляющая пластинка, закрепленная в подвижном держателе (рис. 3). Ширина щели между ножом и расправляющей пластинкой в значительной мере определяет качество срезов.

Рис. 3. Схема расположения ножа криостата н расправляющей пластинки (крностат Dittes-Duspiva).

I—нож криостата, 2—расправляющая пластинка, 3—регулировочный винт для расправляю-щей пластинки, 4— оправа для расправляющей пластинки, 5—регулировочное колесо для расправляющей пластинки.

Срезы наносятся на охлажденные предметные стекла, помещаемые заблаговременно в криостат, и расправляются охлажденной кисточкой. Для оттаивания среза к нижней стороне предметного стекла прижимают палец. В процессе оттаивания срезы расправляются на предметном стекле и приклеиваются к его поверхности. В открытых термостатах рекомендуется непосредственное расправление срезов на предметном или покровном стекле.

Расправленные срезы подвергаются дальнейшей обработке или хранятся в криостате до использования. При этом следует помнить, что в криостате срезы высыхают.

4

2. Методы гистохимии 29

Высыхание можно предотвратить, помещая срезы в закрытый контейнер с обычным льдом. Если высушивание срезов желательно, то этот процесс можно форсировать, помещая в криостат пятиокись фосфора.

Для определенных целей, например при энзимогисто-химических исследованиях, срезы можно инкубировать без высушивания и фиксации или же после предварительной фиксации в течение 15 мин. Для гидролитических ферментов пригодна фиксация в холодном кальций-формоле.

Криостат используется в клинической практике и в исследовательской работе в гистологических и гистохимических лабораториях во всем мире. Его популярность объясняется, кроме того, его растущим значением в радиоавтографии и иммуноцитохимии.

Усовершенствование криостата продолжается; по мнению Пирса, оно должно идти по пути совершенствования микротома и контроля за условиями резки.

2.1.5. РЕЗАК ДЛЯ ТКАНИ, ВИБРАТОМ

Резак для ткани и недавно сконструированный вибра-том обеспечивают быстрое получение тонких срезов фиксированных и нефиксированных тканей без замораживания. Благодаря этому удается в значительной мере избежать нежелательных нарушений структуры, обусловленных в первую очередь оттаиванием замороженного материала и особенно сказывающихся при электронно-микроскопических исследованиях ферментов.

Управление обоими аппаратами не представляет трудности. При работе на резаке модели Sorvall TG-2 объект прикрепляют на фильтровальную бумагу 7%-ным раствором агара или желатины. Агар перед использованием расплавляют на водяной бане (+ 60°С). При этимологических исследованиях агар охлаждают до + 40°С. Затвердевание агара, окружающего ткань, можно ускорить, поместив объект в холодильник. 1

Для резки используется одностороннее лезвие бритвы, закрепляемое в специальном держателе. Хорошие срезы получаются в интервале от 20 до 200 мкм. Трудности наблюдаются лишь при получении срезов нативной ткани (тоньше 100 мкм) таких органов, как мозг, легкие, печень,

30 2. Методы гистохимии

почки или селезенка, однако и эти трудности удается преодолеть при помощи вибратома. Этот аппарат, в котором резка осуществляется с помощью вибрирующего ножа, позволяет получать тонкие срезы (вплоть до 10 мкм) любой растительной или животной ткани без заливки. Он с успехом используется в энзимогистохимических, радиоавтографических и иммуноцитохимических исследованиях.

В электронно-микроскопических исследованиях ферментов при работе с этими двумя аппаратами рекомендуется фиксация перфузией.

2.1.6. КРИОУЛЬТРАМИКРОТОМИЯ

С помощью этого, безусловно, пока еще нового метода можно делать срезы с биологического материала без какой-либо химической подготовки и заливки.

Срезы при низких температурах могут быть получены на производимой фирмой LKB (Стокгольм) приставке "Cryo-Kit", которая легко и быстро монтируется на уль-тратоме этой же фирмы.

Приставка состоит из подвергаемых глубокому охлаждению препаратодержателя и ножедержателя, двух сосудов Дьюара с охлаждающим веществом, а также устройства для регулирования температуры и уровня охлаждающей жидкости. Это приспособление работает эффективно с точной автоматической регулировкой в широком диапазоне температур^ Объемная холодильная камера позволяет разместить в ней необходимые предметы для предварительного охлаждения и хранения.

Электронная регулировка температуры с двумя каналами для препаратодержателя и ножедержателя поддерживает температуру на любом уровне в интервале между —170° С (для препарата) или —150° С (для ножа) и 0° С для жидкости в сосудах с охлаждающим веществом. Охлаждающее вещество подводится из сосудов Дьюара к препа-ратодержателю и ножедержателю автоматически. Для защиты от образования кристаллов льда используются различные жидкости, такие, как глицерин, диметилсуль-фоксид и сахароза.

Помимо нефиксированного материала можно использовать и объекты, фиксированные в альдегидах. В целом

2. Методы гистохимии 31

ряде методов ткань перед замораживанием и резкой заключают в такие среды, как желатина, гуммиакация, ме-тилцеллюлоза или альбумин. Эти среды образуют вокруг объекта своего рода капсулу без пропитывания. По цитохимическому методу Бернара исследуемый материал после фиксации в глутаральдегиде от 30 до 60 мин сначала инкапсулируют в альбумине, а затем для защиты от формирования кристаллов льда обрабатывают диметилсуль-фоксидом.

Ультратонкие срезы получаются при очень низких температурах, около —140° С. Срезы большой площади, наоборот, получаются лучше при температуре от —70 до — 90° С.

Метод криоультрамикротомии лишь начинает применяться в гисто- и цитохимии. Большие перспективы открылись в связи с появлением приставки "Cryo-K.it", позволяющей точно контролировать условия резки. Можно надеяться, что цитохимические исследования в сочетании с криоультрамикротомией, не требующей фиксации и заливки материала, чреватых изменениями структуры ткани, обогатят наши познания в физиологии клетки.

2.1.7. ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ

Фиксация преследует своей целью, «убивая», по возможности стабилизировать структуры в прижизненном состоянии. Однако это требование не удается удовлетворить последующим причинам: в результате химической фиксации в каждом случае вводятся чуждые клетке вещества. Они- образуют соединения с компонентами клетки, что ведет к изменению ее структуры. Вместе с тем фиксация проявляет структуры и высвобождает группы, которые необходимы для связывания красителей, а следовательно, и для окрашивания клетки.

2.1.7.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ

На основании многочисленных экспериментальных данных Цайгер разделил фиксирующие вещества на осади-тели, или коагуляторы, белков и стабилизаторы липидов. К коагуляторам белков принадлежат, в частности, спирт

32 2. Методы гистохимии

и ацетон, кислоты, такие, как уксусная и пикриновая, а также соли тяжелых металлов, например сулема. Эти фиксирующие вещества способны сделать видимыми структуры, которые до того были маскированы из-за сильной гидратации; они могут также, вызывая конгломерацию составных компонентов, переводить в характерный светоми-кроскопический эквивалент структуры, до того невидимые вследствие их субмикроскопических размеров. Этими свойствами объясняется успешное использование таких фиксаторов в светомикроскопической гистохимии.

Согласно все еще актуальным теоретическим представлениям Цайгера, для сохранения прижизненной структуры решающее значение имеет стабилизация жиров и липоидов, образующих липоидный покров опорных структур с имеющимися на них активными группами. К липоидным стабилизаторам относятся четырехокись осмия, альдегиды (например, формальдегид, глутаральдегид) и, с определенными ограничениями, бихромат калия. Слишком интенсивная стабилизация липоидов ведет к экранированию связывающих красители групп и соответственно к ослаблению реакций окрашивания. Фиксирующее вещество особенно хорошо сохраняет структуру >тогда>, когда оно лишь незначительно влияет на окрашиваемость опорных структур, закрепляя их путем поперечного сшивания.

Фиксирующие вещества используются обычно в виде забуференных растворов или смесей. При составлении смеси фиксирующих веществ преследуется цель использовать в процессе фиксации свойства каждого из них. Отдельные компоненты фиксирующей смеси диффундируют в ткань с разной скоростью. Бели в смеси содержится кислый компонент, то он проникает в ткань раньше прочих. Таким образом, на ткани сказывается изолированное воздействие этого компонента прежде чем к месту реакции подоспеют другие буферные или фиксирующие компоненты.

2.1.7.2. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФИКСАЦИЮ

На результаты фиксации помимо непосредственного воздействия фиксирующих сред влияет целый ряд других факторов. В первую очередь это рН и изотоничность фик-

2. Методы гистохимии 33

сирующей смеси, а также температура и продолжительность фиксации.

2.1.7.2.1. рН, ИЗОТОНИЯ, ТЕМПЕРАТУРА

рН фиксирующей смеси оказывает существенное влияние на процесс фиксации. Концентрация ионов водорода должна соответствовать их нормальному ур

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)