Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

овню в тканях (около рН 7,2). Это особенно важно при электронно-гистохимических исследованиях; хорошо известно, что из-за повышенной чувствительности основного вещества цитоплазмы к кислотам кислые растворы искажают ультраструктуры клетки. Легкое закисление среды в клетке, следующее за ее гибелью, не удается нейтрализовать растворами фиксаторов, забуференными до нейтральных величин. Невозможно также при помощи буфера предотвратить смещение изоэлектрической точки в кислую сторону, наступающее под влиянием формальдегида.

Бблыпая часть фиксирующих сред дает кислую реакцию. Фиксирующее действие, основанное главным образом на способности фиксатора консервировать вещества, существенно ослабляется при доведении рН до нейтральных величин. Неизбежные при кислой фиксации повреждения структуры при световой микроскопии имеют меньшее значение, чем при электронной.

Использование растворов фиксаторов, изотоничных тканевой среде, должно ослабить сморщивание или набухание ткани, но не снимает их полностью. При светоопти-ческих исследованиях эта проблема не имеет-большого значения, однако в электронной микроскопии дело обстоит иначе. Здесь отклонение осмотического давления фиксатора от тканевого оказывает нежелательное воздействие на структуру основного вещества цитоплазмы и ци-топлазматических вакуолей. Полезным может оказаться добавление в раствор сахарозы. Независимо от выбора ткани для гистохимических целей наиболее часто используют 7,5%-ный раствор сахарозы. В отличие от макромо-лекулярных соединений (например, поливинилпирролидо-на) сахароза имеет то преимущество, что она легче проникает в ткань.

В последнее время все чаще используют фиксацию на

2-235

34 2. Методы гистохимии

холоду (от 0 до +4° С). В основе этого выбора лежат следующие наблюдения.

1. При температуре холодильника ферментативные процессы резко замедляются; поэтому по сравнению с фиксацией при комнатной температуре процессы аутоли-за сильно подавляются.

2. Под влиянием низкой температуры скорость диффузии фиксирующего вещества меняется лишь незначительно.

Фиксацию на холоду можно считать неотъемлемой частью энзимогистохимического исследования как на световом, так и на электронно-микроскопическом уровне. Что же касается гистохимического выявления веществ на све-тооптическом уровне, то здесь обычно достаточно фиксации при комнатной температуре.

2.1.7.3. ФИКСАЦИЯ ПЕРФУЗИЕЙ

Быстрой остановки аутолитических процессов можно достичь не только фиксацией на холоду, но и перфузией фиксирующего вещества через кровеносную систему. Правильно установленное давление перфузии в течение 10—20 мин обеспечивает равномерную фиксацию клеток и тканей при оптимальной стабилизации структур. Последующая фиксация погружением маленьких кусочков ткани в эту же фиксирующую среду при температуре холодильника на 24 ч позволяет стабилизировать вещества и ферменты на месте их прижизненной локализации. Фиксация перфузией не требует большой затраты времени и считается предпочтительной.

2.1.7.4. ФИКСАЦИЯ В ПАРАХ

Щадящая стабилизация ткани достигается фиксацией в парах. Согласно данным сравнительных исследований для фиксации в парах, можно рекомендовать следующие фиксирующие агенты: формальдегид, акроЛеин, глута-ральдегид, четырехокись осмия, глиоксиловую кислоту, хромилхлорид и этанол.

2. Методы гистохимии 35

2.1.7 ХАРАКТЕР ДЕЙСТВИЯ И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ФИКСИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ

Происходящие во время фиксации процессы можно суммировать следующим образом:

1. Необратимое образование солей с компонентами клетки, выражающееся в выпадении осадков (пикриновая кислота, формальдегид).

2. Химическое сшивание составных компонентов структур (пикриновая кислота, альдегиды).

3. Изменение заряда, т. е. изоэлектрической точки составных компонентов клетки.

4. Химическое изменение компонентов клетки.

5. Изменение числа химических связей в результате растворения или химического разрушения веществ.

6. Изменения ткани в результате сморщивания или набухания (особенно под воздействием этанола и ацетона).

7. Изменения ферментативной активности в результате нарушений вторичной и третичной структуры белка.

Знания о характере действия используемого фиксирующего вещества необходимы для интерпретации результатов гистохимического исследования.

2.1.7.5.1. АЛЬДЕГИДЫ

Механизм действия альдегидов в процессе фиксации зависит в первую очередь от их способности образовывать поперечные связи (сшивки), что особенно благоприятствует сохранению структуры.

1. ФОРМАЛЬДЕГИД,

Благодаря своей способности образовывать мостики между соседними пептидными цепями по принципу окси-метиленовой полимеризации формальдегид может по праву считаться полимеризующим фиксирующим веществом. Формальдегид за счет своего атома водорода легко образует оксиметильный комплекс:

RH + CH20 <± RCH2(OH). За счет другого атома водорода затем образуется мети-

2*

36 2. Методы гистохимии

леяовый мостик (— СН2 —):

RCH2(OH)+HR' tt R—СН2—R'+Н20.

Метиленовые мостики могут подвергаться гидролитическому расщеплению. Стабилизирующее действие формальдегида определяется образованием поперечных сшивок в белках за счет сложных связей. Формальдегид реагирует как обратимо, так и необратимо с целым рядом аминогрупп, с амидами кислот и пептидами.

Обратимы реакции с амино-, имино-, гуанидинов ыми, гйдроксильными, карбоксильными и сульфгидрильными группами, а также с амидами кислот и пептидами.

Необратимы реакции с ароматическим водородом тирозина, триптофана, фенилаланина и гистидина. При использовании формальдегида следует также иметь в виду, что этот фиксатор сдвигает изоэлектрическую точку белков в кислую сторону, что объясняется метилированием свободных аминогрупп.

Формальдегид и смеси с формальдегидом можно использовать в большинстве рядовых гистохимических исследований. Кальций-формол по Бейкеру, используемый при температуре холодильника, хорошо оебя зарекомендовал при выявлении ферментов (особенно гидролитических) и липидов.

2. ГЛУТАРАЛЬДЕГИД „

Глутаральдегид был введен в гистохимию Сабатини, Беншем и Барнетом в первую очередь благодаря его способности сохранять структуру клеток и тканей.

.с—сно н*с\ Глутараяьдееид

Механизм действия глутаральдегида объясняется—в определенной мере подобно формальдегиду—его способностью к образованию стабильных поперечных сшивок, что и обеспечивает сохранение структуры. Кроме того, этот фиксатор способен заполнять пространство между соседними аминогруппами за счет образования мостиков.

2. Методы гистохимии 37

Помимо глутаральдегида, очень хорошими сшивающими агентами являются используемые главным образом в электронной микроскопии другие диальдегиды (табл. 4), которые очень быстро реагируют с активным водородом, с амино- и иминогруппами в белках, а также с гидрок-сильными группами полиспиртов. В процессе фиксации диальдегиды в отличие от моноальдегидов (табл. 4) реагирует не только с активными группами в белках, но и образуют одновременно межмолекулярные мостики. Способности к образованию поперечных сшивок у моноальдегидов примерно такие же, как и у формальдегида. По своей

Таблица 4

Условия фиксации ткани печени крысы ди- и моноальдегидамн (Sabatini, Bensch, Barmen)

Концен- Буфер: Сахароза. Продол- Качество рН

трация, фосфат/ конечная житель- фиксации

какодилат концентрация ность фиксации, ч(блок 1миэ) после ос-

Диальдегиды

Глутаральде- 4-6,5 0,1 М Без до- 0,5-2 А 7,2

гид бавления сахарозы

Глиоксаль 4 0,2 М 0,22- 2-4 Б 6,5

Оксиадишш- 0,33 м алъдегид 12,5 0,1 М 0,44 М 2-6 Б-Г 7,5

Моноальдегиды

Кротональде-

гид > 10 0,1 м 0,44 M 2-6 Б 7,4

Мег акролеин 5 одм 0,22- 2-4 Б 7,6

033 M

Ацетальдегид 10 0,1 м 0,22-0.33M 2-6 Д 7,5

Акролеин 10 одм Без до- 0,5-2 А 7,6

бавле-

ния сахарозы

Пирувальде-

гид 5 одм 0,44 M 2-6 Д 5,5

(насыщенный

раствор)

Формальдегид 4 одм 0,22-0,44 M 2-4 В 7,4

-» Д — от очень хорошей до плохой сохранности.

38 2. Методы гистохимии

способности сохранять структуру альдегиды могут быть расположены в следующем порядке:

1) альдегиды с очень хорошими фиксирующими свойствами: глутаральдегид, акролеин;

2) альдегиды с удовлетворительными фиксирующими свойствами: глиоксаль, метакролеин, кротональдегид, формальдегид;

3) альдегиды с менее удовлетворительными фиксирующими свойствами: оксиадипинальдегид, пирувальдегид, ацетальдегид.

Однако, анализируя данные табл. 4, можно видеть, что способность альдегидов сохранять структуру не всегда коррелирует с их способностью сохранять ферментативную активность. Например, акролеин—плохой фиксатор для ферментов, а альдегиды 3-й группы не подавляют ферментативной активности. Хорошим фиксатором является глутаральдегид, который обеспечивает и сохранность структуры и стабилизацию ферментрв. Благодаря этому он служит основным фиксатором при электронно-микроскопическом выявлении ферментов.

При работе с глутаральдегидом следует обращать внимание на следующее:

1. При гистохимических исследованиях растворы глута-ральдегида должны быть свободны от примесей'; желаемой степени очистки можно достичь лишь путем перегонки под вакуумом; рекомендуется использовать стандартизованные растворы.

2. Требуемую для фиксации оптимальную физиологическую величину рН при работе с глутаральдегидом и другими альдегидами лучше всего устанавливать с помощью какодилатного или фосфатного буфера (табл. 4).

3. В связи с малой скоростью проникновения глута-ральдегида в ткань и во избежание появления зон различной стабилизации подготавливаемые для фиксации кусочки должны быть не толще 2 мм. Наилучшие результаты достигаются с помощью перфузии (10—30 мин) с последующей фиксацией погружением (2—4 ч от 0 до +4° С). Для лучшего контрастирования

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.11.2019)