Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

и стабилизации материала рекомендуется дофиксация в забуференном 1—2%-ном растворе Os04.

4. При большом числе проб фиксированные кусочки

2. Методы гистохимии 39

ткани или срезы можно хранить в холодильнике (от 0 до + 4°С) в забуференном растворе сахарозы (табл. 4) или в растворе гуммиарабика с сахарозой (0,88 М или 7,5%-ный раствор сахарозы с 1% гуммиарабика); хранение в течение нескольких недель, а то и месяцев не сопровождается большими потерями активности гидролитических ферментов.

2.1.7.5.2. ЧЕТЫРЕХОКИСЬ ОСМИЯ

По данным поляризационной и электронной микроскопии четырехокись осмия обеспечивает хорошую сохранность субмикроскопических структур клетки. Щадящая фиксация объясняется главным образом воздействием на белки, которые не коагулируют, а желатинизируются. При этом определенную роль играет и эффект образования сшивок. Минимальное воздействие четырех окиси осмия на структуру по сравнению с другими фиксирующими веществами объясняется процессом желатинизации, который практически не сопровождается сморщиванием ткани. Четырехокись осмия реагирует с белками или их аминокислотными группами и, что особенно характерно, с липи-дами. Различные реакции четырехокиси осмия с активными группами различных аминокислот перечислены в табл. 5.

С четырехокисью осмия реагируют лишь ненасыщенные липиды, которые восстанавливают Os04 с образо-

Таблица 5

Группы различных аминокислот, реагирующие с Os04

Аминокислота Реагирующие группы

Орнитин Вторая а-аминогруппа

Лизин

Цистеин SH-группа

Метионин

Цистин SS-rpynna

Триптофан Индольная группа

Гистидин Имидазольная группа

Пролин

Оксипролин Пиррольная группа

40 2. Методы гистохимии

ванием черного осадка. Имеет значение—особенно в электронной микроскопии—тот факт, что после обработки четырехокисью осмия липиды не могут более растворяться в безводных средах.

Характерной реакцией для четырехокиси осмия является образование нестабильных циклических, легко гидроли-зуемых моноэфиров в результате окисления двойных связей:

сн 0\ НС-0\

и + ),oso2 —»> I )oso2 сн 0>/ 1 не-о'

В результате взаимодействия гидролизованных моноэфиров, перешедших в диольную форму, с другой молекулой моноэфира образуются стабильные диэфиры, что может способствовать образованию поперечных сшивок в ткани. Этот процесс оказывает благотворное влияние на сохранность клеточных структур.

I til

НС-0\ НО-СН НС-0>. /0-СН

I .0»02 + I —*- I ^OsT I

нс-о' но-сн нс-о^и ^о-сн

I I \* 0 ' I

Почернение или побурение, наблюдаемое в клетках и тканях после фиксации осмием, объясняется тем, что часть восстановленного осмия остается в ткани. Благодаря этому четырех окись осмия является активным контрастирующим веществом.

Учитывая механизм действия Os04, при ее использовании в качестве фиксирующего вещества необходимо обращать внимание на следующее:

1. Длительная фиксация в четырехокиси осмия может привести к растворению стабильных диэфиров в результате переокисления.

2. Os04 сдвигает изоэлектрическую точку белков ткани в кислую сторону, в первую очередь, в результате блокирования или разрушения NH2-rpyrai.

3. Os04 оказывает окисляющее действие на биогенные амины, но не реагирует с нативными нуклеиновыми кислотами и полисахаридами.

2. Методы гистохимии 41

Четырехокись осмия используется в основном в ультраструктурных и в ультрагистохимических исследованиях. Для дофиксации в подобных исследованиях она незаменима. Фиксирующее действие Os04 может быть усилено в результате комбинации с другими фиксирующими веществами, например в смеси с глутаральдегидом. Эта смесь при фиксации перфузией с последующей обработкой ура-нилацетатом дает очень хорошие результаты. В комбинации с уранилацетатом осмий фиксирует липиды лучше, чем при фиксации одной четырехокисью осмия. В недавнее время открылась новая возможность использования четы-рехокиси осмия в реакции с осмиофильными веществами, например при электронно-микроскопическом выявлении ферментов.

2.1.7.5.3. ХРОМОВАЯ КИСЛОТА И ХРОМАТЫ

Хромовая кислота и хромат калия окисляют ненасыщенные жирные кислоты, что ведет к стабилизации липидов. Окисленные липиды менее растворимы в растворителях жиров, чем неокисленные. Этот фактор используется при выявлении липидов на парафиновых срезах. Характерной реакцией для хроматов является комплексообразова-ние с водой и способность таких комплексов, подобно формальдегиду, образовывать связи с реакционноспособными группами белка. На окисляющем действии хроматов основана так называемая «хромаффинная реакция», которая выражается в побурении. Этот окислительный процесс ведет к образованию биогенными аминами (например, адреналином, норадреналином, окситриптамином) коричневого пигмента с последующей полимеризацией продуктов окисления.

н,° Ч /СН3 он

СНз

Адреналин Адренохром Г (коричневый пигмент)

42 2. Методы гистохимии

2.1.7.5.4. СОЛИ РТУТИ

Для солей ртути, используемых в различных фиксирующих смесях (например, смесь с суммой по Гайденгайну), типичны следующие реакции:

1. Реакция с кислыми группами белков, особенно с карбоксильными и гидроксильными.

2. Связывание с фосфорной кислотой нуклеопротеидов.

3. Сродство к SH-гругшам, ведущее к образованию очень прочной связи между атомами ртути и серы.

На этом основании фиксирующие растворы с ртутью не могут быть использованы для гистохимического выявления кислых групп и SH-групп, а также для выявления нуклеиновых кислот.

При использовании ртутьсодержащих фиксирующих веществ следует учитывать, что они поначалу быстро проникают в ткань, но затем ведут к образованию труднопроницаемых зон. Поэтому для фиксации следует брать маленькие кусочки. В фиксирующих смесях ртуть применяется в виде сулемы [хлорид ртути (II)]. Обычно используют смеси по Ценкеру и Хелли, сулему в ледяной уксусной кислоте, сулему в спирте, смесь с сулемс;й по .Гайденгайну (Суза), пикриновую кислоту-сулему.

2.1.7.5.5. ЭТАНОЛ И АЦЕТОН

В основе фиксирующего эффекта этанола и ацетона лежит их воздействие на степень гидратации белков. В результате потери воды белковые молекулы уменьшаются в размере и происходит коагуляция плазматического компонента. Таким образом, этанол и ацетон являются типичными осади гелями белков.

В процессе фиксации эти две жидкости проявляют следующие особенности:

1. Снижение диэлектрической постоянной белков с соответствующим усилением взаимного притяжения между молекулами.

2. Возникновение новых стереохимических связей в результате сближения ранее отдаленных групп белковой молекулы.

3. Отсутствие влияния на активные группы белков. Поскольку этанол и ацетон не оказывают необратимо-

2. Методы гистохимии 43

го влияния на активные группы, их можно особенно рекомендовать для гистохимического исследования белков. Сморщивание ткани можно уменьшить добавлением уксусной кислоты или фиксацией на холоду. Обычно этанол используют в высокой концентрации в смеси с уксусной кислотой или же с уксусной кислотой и хлороформом (Карнуа).

2.1.7.5.6. КИСЛОТЫ

Кислоты (например, уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная и др.) в процессе гидролиза воздействуют на гетерополярные валентные связи и способствуют ослаблению состояния гидратации (Цейгер). Они очень быстро проникают в ткань и вызывают своего рода «префиксацию». Чистые кислоты в качестве фиксаторов непригодны. Однако как добавки к фиксирующей смеси они проявляют свое смягчающее действие, препятствуя сморщиванию ткани, благодаря тому, что проникают в ткань быстрее, чем прочие компоненты фиксирующей смеси (табл. 6).

2.1.7.6. СОСТАВ ФИКСИРУЮЩИХ РАСТВОРОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ГИСТОХИМИИ

Фиксация, как правило, является первым важным этапом в гистохимическом выявлении. От правильного выбора фиксирующего вещества и от точного проведения процедуры фиксации зависят результаты и оценка гистохимической реакции. Ошибки, допущенные в процессе фиксаций", не могут быть исправлены при выполнении гистохимической реакции. Для обеспечения сопоставимости результатов гистохимических исследований фиксацию следует проводить в определенное время суток с учетом дневных ритмов клеток. В большинстве гистохимических лабораторий в настоящее время отдают предпочтение химической фиксации, поскольку физические методы (замораживание—высушивание, замещение в замороженном состоянии и др.) требуют специальной аппаратуры или большой затраты времени.

Приведенные ниже таблицы содержат перечень различных фиксирующих средств, рекомендуемых к использо-

Фиксирующие смеси для выявления белков и полисахаридов__Таблиц!

Продолжи- Темпера- Применение

Класс веществ Фиксирующая смесь Состав тельность фиксации тура фиксации, 0 с группа веществ микроскопия Примечания

Белки и аминокислоты Формальдегид по Лилли (Lillie) 40%-ный формальдегид -100 мл; дистиллированная вода-900 мл; NaH2P04 2Н2О-4,0 г, NajHPC^ (безводный) -6,5 г 24-72 ч, срезы -10 мин +4° Тирозин, а-аминокислоты, аргинин, SS-группы Световая, электронная Возможно добавление 7,5%-ной сахарозы

Формальдегид с ацетатом кальция по Лилли (Lillie) Трихлоруксус-ная кислота -этанол по Бар-нету (Barrnett) и Зелигману (Seligman) 40%-ный формальдегид -100 мл; дистиллированная вода-900 мл; ацетат кальция(моногидрат) -20 г 1%-ная трихлоруксусная кислота в 80%-ном этаноле 3-6 ч 12-24 ч 24 ч Комнатная +4° +4° Триптофан SH-группы, SS-группы Световая » Рекомендуется как обычная фиксация

Полисахариды Полисахариды Спиртовый раствор нитрата свинца по Лилли (Lillie) Раствор пикриновой кислоты и формальдегида по Россману (Rossman) 40%-ный формальдегид, нитрат свинца - 8 г, дистиллированная вода-10 мл; 96%-ный этанол - 8 мл Насыщенный раствор пикриновой кислоты в 90%-ном этаноле-90 мл; 40%-ный формальде-гид -10 мл 24 ч 2-3 дня 14 дней 1-4 ч Комнатная +4° -25 от +3 до 0° Кислые му-кополисаха-риды Гликоген » » Целлоиди-нировать срезы не нужно

2. Методы гистохимии 45

ванию в практической ги

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.11.2019)